高度好塩菌蛋白質の高次構造形成と分子育種

2001 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 11660094
• 研究機関: 鹿児島大学
• 研究代表者: 徳永 正雄 鹿児島大学, 農学部, 教授 (20112782)
• 研究分担者: 石橋 松二郎 鹿児島大学, 農学部, 助手 (20305163)
• キーワード: 高度好塩菌 / 好塩菌 / Halobacterium / Nucleoside diphosphate kinase

研究概要

昨年分離した高度好塩菌由来Nucleoside diphosphate kinase遺伝子を大腸菌で発現させたところ、発現蛋白は可溶性画分に検出された。しかし発現蛋白は、ATPカラム結合能がなく、ATPカラムに結合して酵素活性を示す為には、高濃度の塩で処理する必要があった。一旦、高濃度塩存在下で処理したNDKは、塩を透析で除いても、活性を保持しており、これは、高度好塩菌から分離したNative NDKと同じ性質であった。このことから、本NDKは、蛋白質の安定性には塩を要求しないが、そのfoldingには塩を要求するということが示唆された。
次に、発現量の増大と大量精製を目的として、His-tagを付加したHis-NDKの発現を試みた。His-NDKはやはり可溶性画分に回収され、その発現量は30mg/liter cultureとNDKの直接発現に比べ、約60倍という高い発現量を示した。塩存在下でrefoldingさせ、活性を測定したところ、Native NDKとほぼ同様の比括性を示した。
一方、高度好塩菌由来のものと比較するため、真性細菌である中度好塩菌からもNDKを精製し、性質を調べた。ATPカラム、疎水カラムを用いて均一標品を得、塩要求性を調べたところ50mMの塩存在下で最大活性を示し、また、中度好塩菌由来の酵素としては珍しく、3.8MNaClという高濃度でも最大活性の40%の活性を示し、幅広い塩濃度環境下で働くことが判った。

研究成果

• [文献書誌] Ishibashi, Tokunaga, Hiratsuka, Yonezawa, Tsurumaru, Arakawa, Tokunaga: "Nacl-activated nucleoside diphosphate kinase from extremely halophilic archaeon, Halobacterium salinarum, maintains native conformation without salt"FEBS Lett. 493. 134-138 (2001)