多量体α-グルコシダーゼの耐熱化機構と機能発現の解析

1999 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 11660095
• 研究機関: 京都府立大学
• 研究代表者: 鈴木 譲 京都府立大学, 農学部, 教授 (50046471)
• キーワード: 6量体α-グルコシダーゼII / グリコシルヒドロラーゼ・ファミリー31 / Bacillus thermoamyloliquefaciens / 好熱菌 / 遺伝子クローニング / 耐熱性酵素 / 2次構造解析 / 2次構造トポロジー

研究概要

多量体構造のサブユニット間相互作用が好熱菌タンパク質の熱環境への適応戦略となるか否かの分子的基礎情報を得るため、30-60℃の温度領域で生育する通性好熱菌Bacillus thermoamyloliquefaciens KP1071の80℃で10分の半減期を示す分子量540,000のホモ6量体α-グルコシダーゼIIのサブユニットをコードする遺伝子をクローニングし、その遺伝子構造を解析した。その結果、1)酵素サブユニットをコードする遺伝子はpUC18に挿入された4.8-kbp SalI-HindIII DNA断片としてクローニングされた;2)本DNA断片は開始コドンATGと終止コドンATGを保持する2361bpのオープンリーディング・フレームを含み、フレームは787残基よりなる分子量91,070のタンパク質に対応した;3)開始コドン5'上流にはシャイン・ダルガルノ配列とプロモーター・-35/-10配列に対応する配列(GGAGG;TTGCCA/TATATT)が出現した;4)終止コドン3'下流には対称逆方向反復配列が出現した;5)大腸菌で発現され均一に純化された酵素は、N末端7残基を欠落していないが、その他の分子特性(ホモ6量体構造、分子量、耐熱性など)や触媒特性では天然型酵素と一致した;6)酵素サブユニットの一次配列は、グリコシルヒドロラーゼ・ファミリー31に属する古細菌Sulfolobus solfataricus 98/2α-グルコシダーゼの一次配列と34%、B.thermoamyloliquefaciensホモ6量体α-グルコシダーゼIII(分子量530,000)のサブユニットの一次配列と32%、14の真核生物由来のα-グルコシダーゼの一次配列と24-30%(平均26%)一致した;7)他のα-グルコシダーゼと同様に、α-グルコシダーゼIIのサブユニットは三つの二次構造領域、即ち、β構造のN末端領域、二つの触媒残基Asp407とAsp484を含むα/β構造の中央領域、β構造のC末端領域から構成されるβ(α/β)βサンドウイッチ構造の二次構造トポロジー・モチーフをとる、ことが判明した。

研究成果

• [文献書誌] K.Kato, T. Araki, T. Kitamura N. Morita, M. Koori, Y. Suzuki: "Purification and properties of a thermostable inulinase(β-D-fructan fructohydrolase) from Bacillus stearothermophilus KP1289"Starch/Staerke. 7. 253-258 (1999)
• [文献書誌] S. Kashiwabara, S. Ogawa, N. Miyoshi M. Oda, Y. Suzuki: "Three domains comprised in thermostable molecular weight 54,000 pullulanase of type I from Bacillus flavocaldarius KP1228"Biosci. Biotechnol. Biochem.. 63. 1736-1748 (1999)
• [文献書誌] Y. Suzuki: "The proline rule-A strategy for protein thermal stabilization"Proc. Jpn. Acad. Ser. B Phys. Biol. Sci.. 75. 133-137 (1999)
• [文献書誌] K. Watanabe, T. Iwashima, Y. Suzuki: "Features of dnaK operon genes of the obligate thermophile Bacillus thermoglucosidasius KP1006"Antonie van Leeuwenhoek. 77(in press). (2000)
• [文献書誌] K. Watanabe, Y. Fujita, M. Usami, A. Takimoto, Y. Suzuki: "Thermodynamic analysis of Bacillus cereus oligo-1,6-glucosidase and its cumulatively proline-introduced mutant proteins by differential scanning calorimetry"J. Mol. Catal. B: Enz.. 6(in press). (2000)