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本研究の目的は神経細胞における新しいカルシウム(Ca)流入機構である細胞内ストア依存性Ca流入機構の性質及びその細胞内調節メカニズムを明らかにすることである。本年度は神経細胞モデルとして、単離した副腎髄質クロム親和性細胞を用いて細胞内Ca濃度([Ca^<2+>]i)変化とイオンチャネル解析を行い、以下の成績を得た。
1.単一細胞を用いたFura-2蛍光Ca測光法により、外液Ca非存在下でムスカリン受容体及びカフェイン刺激により、一過性に[Ca^<2+>]iは上昇し、次いで細胞内ストアの枯渇が生じた。2.ストア内Caが枯渇した条件下で、細胞外へのCa再導入により[Ca^<2+>]iは外液Ca濃度依存性に増大し、ストアの枯渇がCa流入を促進させる機構が存在することが示された。3.膜電位固定した細胞では、これら刺激によるストア枯渇後のCa再導入による[Ca^<2+>]i上昇は殆ど見られず、Ca流入機構に膜電位依存性があることが示唆された。4.ストア内CaをCa-ATPase阻害薬のタプシガルジン処置により枯渇させると、膜電位固定及び非固定細胞に拘わらず、細胞外Ca存在下では[Ca^<2+>]iは著明に増加した。また、保持電位-60mVではタプシガルジンにより内向き電流が発生した。これに対して、シクロピアゾン酸処置では、ストア内Caは枯渇したがCa流入の促進は顕著ではなかった。5.ストア依存性Ca流入機構の制御にチロシンキナーゼが関与しているか否かを調べるため、既にその性質を明らかにしている平滑筋細胞における阻害薬のスクリーニングの結果、ゲニステイン、チルホスチンはCa流入を抑制したが、ハービマイシンは殆ど影響を与えず、また非選択的陽イオンチャネル阻害薬はCa流入を有意に抑制した。次年度は、副腎髄質クロム親和性細胞に加えて、上頸交感神経節細胞を用いてストア依存性Ca流入機構を調べ、チロシンキナーゼやGキナーゼによる調節機構やチャネル電流解析により、神経細胞に普遍的な性質を明らかにする。更に、申請者が開発したアンペロメトリー法による単一細胞からのカテコールアミン放出を測定することにより、このCa流入の神経伝達物質放出における機能的役割を明らかにしていく予定である。
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