1999 年度実績報告書

機械受容機構の解明 -メカノリセプターの分子実体は何か-

研究課題

研究課題/領域番号	11670037
研究機関	名古屋大学
研究代表者	成瀬恵治名古屋大学, 医学部, 助教授 (40252233)
キーワード	機械受容チャネル / 血管内皮細胞 / 細胞内カルシウム測定法 / クローニング / パッチクランプ法
研究概要	〈cDNAライボラリーの作成〉ヒト血管内皮細胞(伸展刺激により細胞内カルシウム上昇を確認)・トリ心筋(特にSAチャネルの発現がパッチクランプにて確認されている受精後12日目)からcDNAライボラリーを作成した。ライボラリーはファージライボラリーとプラスミドライボラリーの2種類を作成した。これらのライボラリーは10^5から10^6の独立のクローンを持ち、以後のクローニングに用いることが可能と判断された。〈スクリーニング〉 (1)発現クローニング使用した細胞:CHO細胞(既に、SAチャネルが発現していないことを確認)及びCOS7(現在確認中)。遺伝子導入:Effecteneを使用して遺伝子導入を行なった。アッセイ:顕微鏡用細胞伸展刺激装置にてFura2を負荷した遺伝子導入細胞を伸展刺激して細胞内カルシウム上昇をモニターした。遺伝子導入前の細胞に20%、3秒間の一方向伸展刺激を与えても細胞内カルシウム上昇は認められなかった。ヒト血管内皮細胞より分離したプラスミドライボラリーのプールを作り、現在一次スクリーニングを開始した。 (2)ホモロジーによる検索 mec,eNaC,Ca channel,K channelの塩基配列を参考にプローブを設計した。ライボラリースクリーニングの結果、トリ心筋細胞から約3kbpのクローンを得ることができた。現在この配列を決定中である。哺乳類用発現ベクターに組み込んだので、パッチクランプ法にて発現を確認する。

研究成果
(7件)

すべてその他

すべて文献書誌 (7件)

[文献書誌] Yamada T,Naruse K,and Sokabe M: "Stretch-induced morphological changes of human endothelial cells depend on the intracellular level of Ca^<2+> rather than of cAMP"Life Science. (in press). (2000)
[文献書誌] Kanzaki M,Sato C,Kojima I,Naruse K,Sokabe M,Iida H: "Molecular identification of a eukaryotic,stretch-activated nonselective cation channel"Science. 285. 882-886 (1999)
[文献書誌] Kawakubo T,Naruse K,Matsubara T,Hotta N,and Sokabe M: "Characterization of a newly found stretch-activated K_<Ca>,ATP channel in cultured chick ventricular myocytes."Am.J.Physiol.. 276. H1827-1838 (1999)
[文献書誌] Sai X,Naruse K,and Sokabe M: "Activation of pp60^<src> is critical for stretch-induced orienting response in fibroblasts."J.Cell Science. 112. 1365-1373 (1999)
[文献書誌] Borgeld H,Naruse K,Nishikawa S,Zhang J,Kikuchi A,Furukawa K,Yagi: "Appropriately spaced nuclear localizing signals are necessary for nuclear import of non-nuclear proteins."Biophys.Biochem.Res.Com. 256. 278-283 (1999)
[文献書誌] Kada K,Yasui K,Naruse K,and Toyama J: "Orientation Change of Cardiocytes Induced by Cyclic Stretch Stimulation:Time Dependency and Involvement of Protein 1999 Kinases."J.Mol.Cell.Cardio.. 31. 247-259 (1999)
[文献書誌] 曽我部正博、成瀬恵治: "生体膜のダイナミクス"細胞膜の変形と細胞応答-細胞の形が機能を決める?- (印刷中).

1999 年度 実績報告書

機械受容機構の解明 -メカノリセプターの分子実体は何か-

研究代表者

成瀬 恵治 名古屋大学, 医学部, 助教授 (40252233)

研究成果

[文献書誌] Yamada T,Naruse K,and Sokabe M: "Stretch-induced morphological changes of human endothelial cells depend on the intracellular level of Ca^<2+> rather than of cAMP"Life Science. (in press). (2000)

[文献書誌] Kanzaki M,Sato C,Kojima I,Naruse K,Sokabe M,Iida H: "Molecular identification of a eukaryotic,stretch-activated nonselective cation channel"Science. 285. 882-886 (1999)

[文献書誌] Kawakubo T,Naruse K,Matsubara T,Hotta N,and Sokabe M: "Characterization of a newly found stretch-activated K_<Ca>,ATP channel in cultured chick ventricular myocytes."Am.J.Physiol.. 276. H1827-1838 (1999)

[文献書誌] Sai X,Naruse K,and Sokabe M: "Activation of pp60^<src> is critical for stretch-induced orienting response in fibroblasts."J.Cell Science. 112. 1365-1373 (1999)

[文献書誌] Borgeld H,Naruse K,Nishikawa S,Zhang J,Kikuchi A,Furukawa K,Yagi: "Appropriately spaced nuclear localizing signals are necessary for nuclear import of non-nuclear proteins."Biophys.Biochem.Res.Com. 256. 278-283 (1999)

[文献書誌] Kada K,Yasui K,Naruse K,and Toyama J: "Orientation Change of Cardiocytes Induced by Cyclic Stretch Stimulation:Time Dependency and Involvement of Protein 1999 Kinases."J.Mol.Cell.Cardio.. 31. 247-259 (1999)

[文献書誌] 曽我部正博、成瀬恵治: "生体膜のダイナミクス"細胞膜の変形と細胞応答-細胞の形が機能を決める?- (印刷中).

1999 年度実績報告書

成瀬恵治名古屋大学, 医学部, 助教授 (40252233)