| 研究概要 |
マウス・マクロファージからcDNAクローニングされた内向き整流Kチャネル(IRK1)は脳と心臓で強く発現しており,250個のアミノ酸より成る長いC末端領域を持っている。このIRK1のC末端領域の神経細胞における機能・役割を解析する目的で,PC12細胞と培養8日目の初代ラット海馬神経細胞にIRK1遺伝子をリポソーム法でトランスフェクトした。導入されたIRK1遺伝子の産物をウェスタンブロット法で調べたところ,PC12細胞ではその発現が確認されたが,培養海馬神経細胞では検出できなかった。またその発現の分布様式をPC12細胞で免疫組織化学的方法を用い種々検討を行なったが,発現が弱いためか明瞭な結論を得ることが出来なかった。このため遺伝子導入の方法をアデノウイルスを用いる方法に変更した。野生型IRK1遺伝子およびtranslational enhancerとしてVEGFの5'非翻訳領域の配列を持ち,かつN末端側にポリヒスチジンのタグが付いたIRK1遺伝子をそれぞれアデノウイルス・シャトルベクターに挿入した。その後PI-SceIとI-CeuIで切り出し,その断片を試験管内でpAdeno-Xベクターとライゲーションを行い,recombinant adenovirus DNAを作成した。現在,高力価のrecombinant adenovirus粒子を得るためHEK293細胞への感染・増殖を行なっている。
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