| 研究課題/領域番号 |
11670102
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| 研究機関 | 昭和大学 |
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研究代表者 |
小山田 英人 昭和大学, 医学部, 助手 (50266160)
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| 研究分担者 |
小口 勝司 昭和大学, 医学部, 教授 (50129821)
木内 祐二 昭和大学, 薬学部, 教授 (50204821)
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| キーワード | カルシウムイオン / リアノジン受容体 / Tet On-Off |
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| 研究概要 |
(1)tet(テトラサイクリン)トランス作用因子(tTA)を発現するpTef-Off安定細胞株の作製。
tTA遺伝子を含むpTef-Offプラスミド(G418耐性領域を持つ)を培養細胞(CHO細胞)に遺伝子導入し、G418耐性クローンを選択した。この選択したクローン群に緑色蛍光蛋白質(GFP)遺伝子を含むpTRE(後述)を遺伝子導入しGFP蛍光を指標として、tTAを安定して発現している細胞株(pTef-Off安定細胞株)を獲得できた。
(2)Tet-Off安定細胞株でのドキシサイクリン(Dox)依存型リアノジン受容体(RyR)発現。
一つのTetオペレーターDNA配列(TRE)の両側にminiサイトメガロウイルスプロモーターを持つpBIベクターの一方にGFP、他端にCa^<2+>放出チャンネル/RyRをコードする全長cDNAを挿入した発現ベクターを構築した(pBI-EGFP-RyR1)。このpBI-EGFP-RyR1をpTef-Off細胞株(先述)に遺伝子導入したところ、GFP蛍光を発している細胞のみが、作製した抗RyR1D2抗体に認識された。これにより、RyR1を発現している細胞をGFP蛍光を指標として選別できることが判った。また、このGFP蛍光はDoxの培地への添加によって強く抑制された。
(3)GFP蛍光を指標としたリアノジン受容体発現細胞株の機能解析。
このpBI-EGFP-RyR1をpTef-Off細胞株(先述)に遺伝子導入し48時間後に、Ca^<2+>蛍光指示薬(Fura2/AM)を負荷して細胞内Ca^<2+>イオン動態を調べたところ、このGFP蛍光を発している細胞のみでカフェイン刺激による細胞内Ca^<2+>イオンの上昇が認められた。これにより、GFP蛍光がRyR1の機能的発現の指標となることが判った。
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