| 研究概要 |
サイクリンキナーゼインヒビターp57KIP2遺伝子はBeckwith-Wiedemann症候群の原因遺伝子である。その変異体が細胞及び個体レベルでどのような表現型を示すのかを明らかにするために、今年度はヒト遺伝子の変異体を作成して細胞に感染させ形態学的、生化学的変化が見られるかを観察した。それから、来年度のトランスジェニックマウス作成の為の組換え体の作成も試みた。細胞レベルでの変化を観察するために、最初は一過性発現によるアッセイを検討していたが、安定株を得てそれによる検討をすることに改めた。そのために、ベクターとしてアデノウイルスを使用し、細胞株はG401,RD細胞を使用した。導入する変異体はpDR2-1-8(p57KIP2のC末に変異がある変異体)およびコントロールとしてpDR2-1(野性組換え体)を使用した。アデノウイルスベクターに組み込んだ組換え体をG401に感染させたところ、発現が観察されなかった。組換え体の構造を制限酵素による切断で調べたところ、別に問題はないと考えれた。そこで、RD細胞を用いて同様のことを確かめた。その結果、moi=50でpDR2-1、pDR2-1-8両組換え体にウエスタンブロットで蛋白の出現が認められた。p57KIP2による抗体染色ではバックグラウンドにも染色は認められたが、感染細胞では明らかに染色が濃くなっているのが観察された。ただ、気になるのは野性体、変異体両組換え体で細胞増殖に差が見られると予想していたのが、あまり変わらないくらいに抑制された。細胞に感染させる際のmoi等再検討する必要があると考えられる。なお、この両組換え体を感染させた細胞では形態学的な明確な差は観察されなかった。なお、トランスジェニックマウス作成の為の組換え体の作成は、プロモーターはpRC/CMVを用いた。組換え体はpDR2-1(野性体),pDR2-1-6(変異体),pDR2-1-8(変異体)の三種類である。
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