E-セレクチン糖蛋白リガンド(gp150)の遺伝子クローニングとその機能の解明

2000 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 11670147
• 研究機関: 自治医科大学
• 研究代表者: 中村 充 自治医科大学, 医学部, 講師 (20198237)
• キーワード: Sialyl-Le^X / E-Selectin / Counter Ligand / Cell Adhesion / Sialomucin family / O-linked Glycoprotein

研究概要

ヒトプレB細胞表面にはシアリルルイスーX(sLe^X)糖鎖抗原が強発現し、細胞接着などに関与しているものと考えられている。プレB細胞表面sLe^X抗原構造は、糖脂質にもN-グリコシド型糖鎖にも載っておらず、O-グリコシド型糖鎖だけに発現する。しかも、同じO-型糖鎖でも、分子量150kDaのほとんど唯一の特定糖蛋白質(gp150)上のO-型糖鎖末端に好んで発現する。またプレB細胞の場合、表面sLe^X発現レベルは、コア2GlcNAc転移酵素(C2GnT)の律速調節を受けている。我々は、律速酵素C2GnTが好んで作用するこのgp150を、B細胞におけるE-セレクチン糖蛋白リガンドのキャンディデイトと考えて本研究を進め、次のことを明らかにした。
1.C2GnTによる細胞表面sLe^X発現レベル調節は、プレB細胞のみならず、扁桃由来のB細胞活性化においても示された。
2.このgp150は、Pasteurellahaemolytica由来のO-sialoglycoproteinendopeptidase処理によって、抗sLe^Xモノクローナル抗体反応性が消失したことから、シアル酸を末端に持つO-型糖鎖に富んだシアロムチンタイプの糖蛋白質分子であることが示唆された。
3.抗sLe^Xモノクローナル抗体を結合させたプロテイン-Gを用いてプレB細胞株NALL-1膜画分からgp150を調製し、ペプチドフラグメントを精製してアミノ酸一次構造を解析したところ、あるシアロムチンタイプの糖蛋白質分子であることが判明した。それはその蛋白質部分に対する抗体を用いた免疫染色によっても確認できた。また逆に、蛋白部分を認識する抗体を結合させたプロテイン-Gを用いて免疫沈降をして精製した蛋白を、抗sLe^X抗体で染色することによっても確認できた。
4.さらにそのシアロムチンタイプの糖蛋白質をコードする遺伝子をアンチセンス方向にドライブして、プレB細胞sLe^X高発現株に発現させたところ、sLe^X抗原発現が有意にダウンレギュレーションし、E-セレクチンを介する細胞接着性が著しく低下した。

研究成果

• [文献書誌] Nakamura,M., et al.: "UDP-GlcNAc:Galβl→3GalNAc βl→6N-acetylglucosaminyltrans-ferase Holds a Key Role on the Control of CD 15s Expression in Human pre-B Lymphoid Cell Lines."Glycobiology. 9(1). 1-12 (1999)
• [文献書誌] Yang,W.,Asakura,S.,Sakai,T.,Nakamura,M., et al.: "Two-step Spreading Mode of Human Glioma Cells on Fibrin Monomer via a βl Integrin."Thromb.Res.. 93. 279-290 (1999)
• [文献書誌] Furukawa,Y.,Iwase,S.,Kikuchi,J.,Nakamura,M., et al.: "Transcriptional Repression of the E2F-1 Gene by Interferon-a Is Mediated through Induction of E2F-4/pRB and E2F-4/pl30 Complexes."Oncogene. 18. 2003-2014 (1999)
• [文献書誌] Nakamura,M., et al.: "Simultaneous Core 2 β1→6N-Acetylglucosaminyltransferase Up-regulation and Sialyl-LeX Expression During Activation of Human Tonsillar B Lymphocytes."FEBS Lett.. 463. 125-128 (1999)
• [文献書誌] Muroi K,Tarumoto T,Akioka T,Kirito K,Nagai T,Izumi T,Nakamura M, et al.: "Sialyl-Tn- and Neuron Specific Enolase-Positive Minimally Differentiated Erythroleukemia."Internal Medicine. 39(10). 843-846 (2000)
• [文献書誌] Furukawa Y,Iwase S,Kikuchi J,Terui Y,Nakamura M, et al.: "Phosphorylation of Bcl-2 Protein by CDC2 Kinase during G2/M Phases and its Role in Cell Cycle Regulation.J.Biol.Chem.275 (28): 21661-21667,2000."J.Biol.Chem.. 275(28). 21661-21667 (2000)
• [文献書誌] Kikuchi J,Furukawa Y,Kubo N,Tokura A,Hayashi N,Nakamura M, et al.: "Induction of ubiquitin-conjugating enzyme by aggregated low density lipoprotein in human macrophages and its implications for atherosclerosis."Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.. 20(1). 128-134 (2000)
• [文献書誌] Furukawa Y,Kikuchi J,Nakamura M, et al.: "Lineage-specific Regulation of Cell Cycle Control Gene Expression during Haematopoietic Cell Differentiation. Br.J.Haematol.110 : 663-673,2000."Br.J.Haematol.. 110. 663-673 (2000)
• [文献書誌] Kikuchi J,Furukawa Y,Suzuki O,Hayashi N,Nakamura M, et al.: "A Simple Semisolid Subtraction Method Using Carbodiimide-Coated Microplates.Molecular Biotechnology 15:193-200,2000."Molecular Biotechnology. 15. 193-200 (2000)
• [文献書誌] 中村充: "接着分子シアリルLewis-Xの発現調節"臨床免疫. 31(5). 616-622 (1999)
• [文献書誌] 中村充: "ミニレビウ-白血球細胞分化と表面糖鎖生合成制御"生化学. 72(6). 451-455 (2000)
• [文献書誌] 中村充 ほか: "生物薬科学実験講座-第1巻生体構成成分と高分子."廣川書店(東京). 11 (2000)
• [文献書誌] 中村充: "医学大辞典"医学書院(東京)(印刷中). (2000)