リボザイムによる肺癌の進展に関わる血管内皮増殖因子アイソフォームの機能解析

1999 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 11670227
• 研究機関: 東海大学
• 研究代表者: 中村 雅登 東海大学, 医学部, 講師 (00164335)
• 研究分担者: 上山 義人 東海大学, 医学部, 助教授 (30072408)
• キーワード: 血管内皮増殖因子 / アイソフォーム / リボザイム / 肺癌 / 遺伝子導入

研究概要

平成11年度の研究ではVEGF189を特異的に分解するリボザイムの作成と培養細胞への組み込みを中心として実験を進めた。まず、ヒト非小細胞肺癌株(OZ-6、Calu-3等)より細胞全RNAを精製し、これを鋳型としたRT-PCR法によってVEGF mRNAのアイソフォームの発現形式を明らかにするために、Exon 1〜Exon 8およびExon 4〜Exon 7にプライマーを設計しPCRを行い、増幅されたcDNAフラグメントのサイズから各アイソフォームの有無を確認した。ついで、細胞関連型のVEGF189アイソフォームに特異的に存在するExon 6の塩基配列を標的としたハンマーヘッド型リボザイム(V189Rz)を作成した。人工的に作成したRNA基質を用い、このV189Rzの特異性・切断活性をin vitroで解析し、至適pH、温度、Mg濃度を確認することができた。さらに、細胞関連型VEGF189の発現の確認された非小細胞肺癌培養細胞株を用い、in vitroで分解活性の確認されたリボザイムをベクターpHbに組み込む(pHb/V189Rz,pHb/dis-V189Rz)をリポフェクションにより遺伝子導入した。RT-PCR・シークエンス解析でリボザイムの導入を確認し(OZ-6/VR)、同定されたリボザイム導入細胞株を用いて、現在、細胞生物学的解析を行いつつある。

研究成果

• [文献書誌] Okamoto K, et al.: "Xenografts of human solid tumors frequently express cellular-associated isoform of vascular endothelial growth factor (VEGF) 189"Oncology Reports. 6. 1201-1204 (1999)
• [文献書誌] Lee Y H, et al.: "Cell-retained isoforms of vascular endothelial growth factor (VEGF) are correlated with poor prognosis in osteosarcoma"European Journal of Cancer.. 35(7). 1089-1093 (1999)
• [文献書誌] Okamoto K, et al.: "Inhibition of liver metastasis of colon cancer by in vivo administration of anti vascular endothelial growth factor antibody"Oncology Reports.. 6. 553-556 (1999)
• [文献書誌] Tomisawa M, et al.: "Expression pattern of vascular endothelial growth factor isoform is closely correlated with tumour stage and vascularization in renal cell carcinoma"European Journal of Cancer.. 35(1). 133-137 (1999)
• [文献書誌] Tokunaga T, et al.: "Thrombospondin 2 expression is correlated with inhibition of angiogenesis and metastasis of colon cancer"British Journal of Cancer.. 79(2). 354-359 (1999)
• [文献書誌] Tsuchida T, et al.: "Hammerhead ribozyme specifically inhibits mutant K-ras mRNA of human pancreatic cancer cells"Biochemical and Biophysical Research Communications. 253. 368-373 (1999)