狂犬病ウイルスのヌクレオプロティンのりん酸化の意義について

2000 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 11670293
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 河合 明彦 京都大学, 薬学研究科, 教授 (70027332)
• 研究分担者: 栃倉 匡文 京都大学, 薬学研究科, 助手 (10291428)
• キーワード: 狂犬病ウイルス / ヌクレオプロティン / タンパク質のりん酸化 / モノクローナル抗体 / 立体構造変換 / RNA結合タンパク質 / りん酸化タンパク質 / ヌクレオカプシド

研究概要

狂犬病ウイルスのRNA結合タンパク(Nタンパク)はりん酸化タンパク質であるが,本研究課題では,そのりん酸化の意義や役割についての検討を主題とするものである.
1)まずNタンパクに対する我々のモノクローナル抗体(mAbと記す)の中から,(1)りん酸化されたNタンパクのみを認識するmAb(#5-2-26),および(2)立体構造的エピトープを認識するmAb(#1-7-11など)を見いだした.これらのmAbを用いて,Nタンパクのりん酸化過程などの修飾,成熟過程を調べた.
2)NタンパクはウイルスRNAに結合してヌクレオカプシド(NCと記す)を構成するタンパク質であるが,NタンパクがRNAに結合する前の段階ではりん酸化されていないことが,りん酸化によって形成されるエピトープを特異的に認識するmAb(#5-2-26)を用いた実験から明らかになった.
3)RNAに結合していないフリーのNタンパクはPタンパクに結合しており,これらはdeoxycholateの存在下で分離し,また分離したNタンパクはどのmAbとも反応しなかった.即ち,フリーのNタンパクのエピトープ部位がPタンパクとの結合により隠れていたわけではないことが示唆された.
4)りん酸化されない変異NタンパクもRNAと結合してNCを形成する.これはNタンパクのりん酸化はRNAに結合してNCを形成する過程あるいは形成した後に起こることを示唆する.
5)りん酸化されない変異Nタンパクを用いた実験や他のmAb(#1-7-11など)との反応性の変化から,NCを形成したNタンパクは立体構造を変化させ,この変化はりん酸化を必要としないことが分かった.
6)このようなRNAとの結合により生じるNタンパクの立体構造の変化はその後に行われるりん酸化の有無に関わらず可逆的で,NタンパクをRNAから剥がすと元の立体構造に戻る.
7)PタンパクはNCと結合すると立体構造を変化させ,NCとの結合がより強固になる.逆に,りん酸化されない変異NタンパクがRNAと結合したNCはPタンパクとの結合が非常に弱いことが分かった.
8)NCに結合した時に起こるPタンパクの立体構造の変化にはNタンパクのりん酸化が不可欠であり,この変化はウイルスRNAポリメラーゼの触媒サブユニット(Lタンパク)の結合に非常に重要であることが示唆された.

研究成果

• [文献書誌] 蘭颯: "The rabies virion-associated 100-kDa protein (VAP100) is a host-derived minor component of the enveloped viruses."Microbiology and Immunology. 44・8. 657-668 (2000)
• [文献書誌] 五藤秀男: "Mapping of epitopes and structural analysis of antigenic sites in the nucleoprotein of rawles virus."Journal of General Virology. 81・1. 119-127 (2000)
• [文献書誌] 河合明彦: "Nucleocapsid formation and/or subsequent conformational change of the rabies virus nucleoprotein (N) is a preraguisite stop for acquisition of its phosphatase-sensitive epitope recognized by manodmal antibody 5-226"Virology. 263・2. 395-407 (1999)
• [文献書誌] 坂口剛: "Double layered membrane vesicles released from mammalian cells infested with Sondai Virus expressing the matrix protein of vesicalsa stomatitis virus"Virology. 263・1. 230-243 (1999)
• [文献書誌] 坂本信一: "Studies on the structures and antigenic properties of rabies vims glycoprotain analogues produced in yeast cells"Vaccine. 17・3. 205-218 (1999)
• [文献書誌] 中原宏一郎: "Intracellalas behavior of rabies virus matrix protein (M) is determined by the urral glycoprotein (G)"Microbiology and Immunology. 43・3. 259-270 (1999)