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今年度はPCR-SSCP法によるHLA-DMB遺伝子の各エキソン領域における多型性のスクリーニング法を検討した。
新鮮血から抽出したDNA試料についてHLA-DMB遺伝子のエキソン1領域についてプライマー設計ソフトを用いてこの領域全体を増幅するプライマーを作成した。センスプライマーとアンチセンスプライマーとして5'TTCCTGCCGCTGCTGC3'と3'TGTCCTCGTCCACCGAA5'を用いてhot start PCRを行ない最適条件を探した。プライマーは2.0〜2.5pmol/μl、AmpliTaq【○!R】Gold 2U、template DNA 05μgを使用しPCR反応液は50μlとしPCRを40サイクル行なったところ良好な増幅産物収量を得ることができた。
多型性をスクリーニングする目的でsingle-strand conformation polymorphism〈SSCP)法でPCR増幅産物について分析を試みた。即ちPCR産物とホルムアミド色素液を混合し80℃で5分間インキュベートした後氷冷し、その2μlをグラジエントポリアクリルアミドゲルにアプライしスラブ電気泳動を行ない、泳動終了後銀染色にてSSCPバンドを検出した。その結果エキソン1には現在までに2種類の泳動像を確認した。これらのSSCP法で得られたバンドについてダイレクトシークエンスを行ないその塩基配列を調べ報告されている配列と比較検討する予定である。
現在のところ本研究の分析法を検討しており試料数が少ない段階であるが、エキソン2〜エキソン6についても同様に検査し、SSCP法でスクリーニング後各型についてダイレクトシークエンスで塩基配列を決定する予定である。また来年度は塩基配列に基づいてHLA-DMBアリルの特徴的な塩基配列領域をターゲットとしたプライマーを設計しhot Start PCR-SSP法にてHLA-DMB遺伝子のタイピングを目指す予定である。
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