|
C型肝炎ウイルスの外側のエンベロープ蛋白(E1、E2)の培養細胞での発現系を構築し、どの部分がヒト細胞膜上のレセプターとの結合に関与するかを検討する。まずセロタイプ1型でウイルス量の多い数人の患者血清よりC型肝炎ウイルスのmRNAを抽出した。そのmRNAより、逆転写酵素を用いてcDNAを合成し、遺伝子型に応じたプライマーを用いてPCRをおこなうことでE1、E2遺伝子を増幅した。PCR産物を発現ベクターに組み込んでクローニングし、シークエンスを確認した。6xHisTagをつけたエンベロープ蛋白(E1、E2)をCOS7細胞に導入して、抗6xHis抗体でその発現を確認することができた。また発現蛋白を6HisTagによりNiカラムとのaffinityで部分精製した。現在蛋白の収量を増やすべく検討している。ヒトリンパ球系の細胞であるMolt4は、C型肝炎ウイルスが感染する可能性が報告されており、レセプターを細胞表面にもつと考えられている。この細胞と精製したエンベロープ蛋白(E1、E2)を混合し、6xHisTagに対する抗体を用いFACscanにより、結合性を確認する予定。また最近レセプターの候補分子として報告されたCD81に関しては、ヒト遺伝子をlibraryよりPCRでクローニングし、発現ベクターに組み込んだ。これをCOS7細胞に導入してFACscanにより細胞表面に発現していることを確認した。このヒトCD81発現COS7細胞に、ウイルスの存在する血清を加えて培養した。時間経過を追って細胞とその上清についてRT-PCRを用いてHCvirusのnegative strandの検出を試みたが、現在のところ有意な所見は得られていない。HIVと同様なco-receptorが存在する可能性もあるものと思われる。
|
