| 研究概要 |
最近MutSミスマッチ結合蛋白を応用して様々な部位に異常があっても高感度に遺伝子異常の有無を検出できることがLishanskiやWagnerにより実験的に示されている。そこで,4つの膵癌細胞株(PANC-1,PaCa-2,BxPC-3,HIPAF)よりDNAを抽出した。一方、K-ras exon 1,p53のexon5〜8のそれぞれに対するビチオンを標識したプライマーを作成した。PCRにて増幅後,熱変性,再アニーリング処理を行ない,遺伝子異常がある場合は二本鎖heteroduplexが形成されるが,それがない場合は二本鎖homoduplexのみが形成される。ニトロセルロース膜上に固相化したMutS蛋白と反応させ,二本heteroduplexを特異的に認識して結合するというMutS蛋白の性質を利用して,MutS蛋白に特異的に結合した変異を含むミスマッチPCR産物をストレプトアビジンHRPを用いた化学発光(ECL)検出法にて検討した。K-rasコドン12のGGT(Gly)へのhomozygous mutationsを示すPaCa-2ととK-ras変異のないBxPC-3は、2本の鎖DNAが相補的であるため、プライマーを除去したPCR産物の熱変性、再アニーリング処理後も、理論上homoduplexのみしか形成されない。一方、PANC-1,HPAFはGGT(Gly)からGAT(Asp)へのheterozygous mutationであるので、同様な処理によりheteroduplexを形成すると考えられる。P53についても、各4種類の膵癌細胞株に、それぞれPANC-1(exon 8),PaCa-2(exon 7),BxPC-3(exon 6),HIPAF(exon 5)の変異が確認されており、同様な処理により、heteroduplexを形成すると想定される。Fidelityの高いPfu DNA polymeraseやPyrobest DNA polymeraseを用いて、PCR30サイクルで行なった。本法は、検出感度は極めて高いが、K-rasならびにp53変異の偽陽性を示す例が、膵癌細胞株の検討で20%から25%に認められた。特異性に問題がみられ、条件設定を調整しているが、PCR時のmisincorporationあるいは、MutSとの結合反応後の不完全な洗浄による非特異的ビチオン残留の影響の可能性があり、さらに検討中である。臨床サンプルについても同様に検討予定である。
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