| 研究概要 |
11年度に引き続、糖鎖腫瘍マーカー産生量の異なるヒト胆管癌TK細胞(wild type)と遺伝子導入細胞の超音波細胞破砕液を用いてヒトα-1.3-フコース転移酵素(Fuc-T)の活性測定をHPLCで行った.Gal β 1,4GlcNAc β 1,3Gal β 1,4Glc[Lacto-N-neotetraose(LNnT)](II型糖鎖)およびGal β 1,3GlcNAc β 1,3Gal β 1,4Glc[Lacto-N-tetraose(LNT)](I型糖鎖)をピリジルアミノ(PA)誘導体化したものをアクセプター基質として腫瘍細胞破砕液と反応させた後、HPLCの溶出パターンから活性を測定した.その結果Fuc-TIII酵素についてはwild type腫瘍細胞および遺伝子導入細胞で同程度の活性が確認された.Fuc-TVII酵素についても明らかな活性パターンの差は得られなかった.
また遺伝子レベルでの解析は、ヒトFuc-TIII酵素についてgene-specific:CCACCCGGGAGTGATGGTTCTGGCTGATTT(F)/CGATCCCACCTGTACCCTATAAGTGGTGGT(R)およびFuc-TIII,TV,TVI:CTCGAATTCACCCATGGATCCCCTGGGTGCAGC(F)/CTCA AGCTTCTCTCAGGTGAACCAAGCCGCTATG(R)の2組のオリゴヌクレオチドプライマーを作製しPCR法でwild type腫瘍細胞と遺伝子導入細胞で解析を行った.Fuc-TVII酵素に関してもORFオリゴヌクレオチドプライマー:CTCGGATCCAATCTCGGGTCTCTT GGCTG(F)/CTCGAATTCGGTGG TTTGATTTCGACACC(R)を作製しwild type腫瘍細胞と遺伝子導入細胞より抽出したRNAでRT-PCR法による解析を行った.特にFuc-TIII酵素についてはgene-specific PCR産物についてシークエンスも行ったが配列に変化はなかった.Fuc-TVII酵素についてもPCR法での発現差は示されなかった.Fuc-TVII-PCR産物は発現ベクターであるpcDNA2に組み込む過程まで進んだ.しかし腫瘍拒絶に糖鎖がどのように影響するかについてのin vivo実験は進まず、SCIDマウスを用いて遺伝子導入細胞に対する腫瘍拒絶が存在することを確認するに止まった.
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