| 研究概要 |
Parkinが、apoptosisに関与するかを以下の方法で検討した。
1)wild-type Parkinをmyc-pcDNA3に組み込んだvectorを作った。293細胞にtransfectし、westernblotによりその発現を確認した。
2)293細胞において、Fasとbaxの発現は、caspase活性化経路のほとんどを活性化するが、Parkinの同時発現により、それを抑制できなかった。positive controlは、caspase阻害蛋白XIAPを使用した。Etoposide,Menadione,血清除去によるapoptosisに対しても、COS-1細胞でも同様の結果を得た。
3)cell-freeのapoptosis実験として、293細胞のlysateに、cytCとATPをいれて、invitroでcaspaseを活性化した。大腸菌から精製したGST-parkin下でも、caspaseの活性化は抑制されなかった。positivecontrolとしては、caspase阻害蛋白XIAPを用いた。caspase活性のfluorometricassayでも同様の結果を得た。
4)yeast-twohybrid法により、bcl-2、NAIP,XIAPなどのapoptosis関連遺伝子との結合を調べたがすべて陰性であった。現在、cDNAlibrarryによる結合蛋白のスクリーニング(yeast-two-hybrid法)に入っている。
以上より、293細胞においては、parkinのcaspase下流経路に対する抑制は、in vivo,in vitroにおいて、認めなかった。293細胞でapoptosis抑制がないということは、parkinがneuron内のcaspase経路にdirectに作用する蛋白ではないことが予想される。
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