チロシナーゼ遺伝子上流領域を組み込んだアデノウイルスベクターの開発

2000 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 11670842
• 研究機関: 札幌医科大学
• 研究代表者: 山下 利春 札幌医科大学, 医学部, 講師 (50167706)
• キーワード: メラノーマ / 遺伝子治療 / チロシナーゼ / 転写調節領域 / p53 / p51A / アデノクイルスベクター / アポトーシス

研究概要

p53ファミリーを発現するアデノウイルスを用いて、メラノーマ細胞株に対する遺伝子治療の基礎的研究を行った。1)p53ファミリーp53、p51A、p73βの各cDNAをPCRによって合成し、ヒトサイトメガロウイルス初期プロモーターにより発現する組み換えアデノウイルスを作製した。6株のヒトメラノーマ細胞株のp53を酵母の機能的アッセイ法により解析した結果、6株中1株(70W)のみにp53のミスセンス変異を見い出した。組み換えアデノウイルスを用いて細胞死の誘導を検討した結果、6株中、3株(SK-mel-23,SK-mel-118,70W)にp53ファミリーによるアポトーシス誘導を認めた。すなわち、p53ファミリーは変異型だけでなく野生型p53を発現するメラノーマ細胞にもアポトーシスを誘導した。p53ファミリーのなかでも、p51Aがメラノーマ細胞に最も強いアポトーシス誘導活性を示した。p51A発現SK-mel-118細胞に明らかなCaspase3の活性化を認めたため、デイファレンシャルデスプレイを用いて、p51AによりSK-mel-118細胞に発現誘導される細胞遺伝子のクローニングを行ない、いくつかのcDNAを得た。2)チロシナーゼはメラニン合成過程の最初のステップで働く酵素で、メラノサイト特異的に転写され発現する。チロシナーゼ遺伝子の5'上流配列3.6キロ塩基対(kb)の配列を決定し、この3.6kbのチロシナーゼプロモーターをp53、p51A,およびアデノウイルスE1Aの上流に結合した組み換えプラスミド(p3.6-p53,p3.6-p51A,p3.6-E1A)を作製した。さらに、これらの転写単位を組み込んだアデノウイルスを作製した。p3.6-E1Aとp3.6-p53はメラノーマ細胞に細胞死を誘導したが、p51Aは逆にメラノーマ細胞の増殖を促進した。すなわち、p51Aは発現量によってメラノーマ細胞の増殖に対し異なる効果を示した。

研究成果

• [文献書誌] Ishida S,Yamashita T,Nakaya U and Tokino T: "Adenovirus-mediated transfer of p53-related genes induces apoptosis of human cancer cells."Jpn J Cancer Res. 91(2). 174-180 (2000)
• [文献書誌] Oda E,Ohki R,Murasawa H,Nemoto J,Shibue T,Yamashita T. et al: "Noxa, a BH3-only member of the Bcl-2 family and candidate mediator of p53-induced apoptosis."Science. 288(12 May). 1053-1058 (2000)
• [文献書誌] Kaneuchi M,Yamashita T,Shindoh M,Segawa K,Takahashi S, et al: "Induction of apoptosis by the p53-273L (Arg-Leu) mutant in HSC3 cells without transactivation of p21^<Wal1/Clp1/Sdl1> and Bax."Mol Carci. 26. 44-52 (1999)
• [文献書誌] Yamashita T,Tonoki H,Nakata D,Yamano S,Segawa K,Moriuchi T: "Adenovirus type 5 E1A immortalizes primary rat cells expressing wild-type p53."Micro Immunol. 43(11). 1037-1044 (1999)
• [文献書誌] Yamano S,Tokino T,Yasuda M,Yamashita T et al: "Induction of transformation and p53-dependent apoptosis by adenovirus type 5 early region 4 ORF6/7 cDNA."J Virol. 73(12). 10095-10103 (1999)
• [文献書誌] Nakaya U,Yamashita T,Odajima T,Shindoh M,Tokino T, et al: "Wild-type p53 expression overcomes p21-mediated G1 arrest and induces apoptosis in cancer cells expressing Bax."Tumor Res. 34. 69-81 (1999)