| 研究分担者 |
桜井 敏晴 慶應義塾大学, 医学部, 助手 (20101933)
藤田 知信 慶應義塾大学, 医学部, 助手 (20199334)
河上 裕 慶應義塾大学, 医学部, 教授 (50161287)
冨田 眞人 慶應義塾大学, 医学部, 助手 (90296608)
鈴木 ゆり子 慶應義塾大学, 医学部, 助手 (40255435)
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| 研究概要 |
抗原ペプチドと結合した可溶性HLAテトラマー分子の作製
1.HLA-A2ないしA24の第一ATGを含む5'側プライマーと,Bir A(E-coli biotin holoenzyme synthetase,ビオチン化酵素)の基質ペプチド(Bir A substrate peptide;BSP)とグリシン・セリンリンカーを介してHLAのα3ドメインに連なる3'側プライマーを用いて,すでにクローニングされているHLA-A2ないしA24cDNAを鋳型にPCR法を行った(PCR法により得られたHLA分子は3'側の膜貫通領域を欠く)。両プライマーはそれぞれ異なる制限酵素切断部位を有する。
2.制限酵素消化後,大腸菌蛋白発現ベクターpHN1+にクローニングし,常法により大腸菌に蛋白を大量発現させ,HLA分子モノマーを封入体として回収した。封入体を尿素により変性した後,希釈法と限外濾過法を用いて可溶化したHLA分子モノマーを,種々のプロテアーゼ阻害剤存在下でHLA結合性ペプチドおよびβ2ミクログロブリンと共に適当な立体構造を保持するように巻き戻した。本年度は既に同定されているHLA-A2に結合するインフルエンザペプチドあるいはHLA-A24に結合するEBVペプチドを用いて合成を進めた。
3.25℃,12時間Bir A(Avidity社)存在下でビオチン化したHLA-ペプチド分子をゲル濾過クロマトグラフィー,続いてイオン交換クロマトグラフィーにより精製後,4:1のモル比にてフィコエリスリン(PE)標識したストレプトアビジンに結合させ,可溶性HLA-ペプチドテトラマー分子を作製した。
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