| 研究概要 |
アポトーシスの際に活性化されるエンドヌクレアーゼとして、従来よりNuc18,DNase I, DNase II, DNaseγなどが報告されてきたが、1998年にEnariらはCaspase-3により直接的に活性化される新しいエンドヌクレアーゼCAD(Caspase activated DNase)を発見した。我々はヒト白血病細胞HL-60のアポトーシスの際にcaspase-3により活性化される34kDaのMg^<2+>依存性ヌクレアーゼを精製・同定しAN34(Apoptotic Nuclease 34kDa)と命名した。この酵素の生化学的な性質について検討を加えた。3'末端または5'末端を^<32>Pで標識した20 mer oligo DNAを基質として、精製した蛋白を作用させたのち変性アクリルアミド電気泳動で分析したところendonuclease活性のみならず、3'-5' exonuclease活性をもつことがわかった。AN34をQ-sepharose, Heparine-sepharose, Hydroxyapatite, Mono-S, Superose-12の5種類のカラムを用い精製した後、SDS-PAGEにて精製蛋白を分離した。目的の蛋白をトリプシンで消化後、蛋白のアミノ酸配列をMALDI-MSおよびES-MSを用いて分析したところ、精製された蛋白はAP-endonucleaseであることが判明した。精製した蛋白がAP-endonuclease活性を有しているかどうか検討したところ、有していることが確認された。AP-endonucleaseに対するポリクローナル抗体を用いて免疫染色により細胞内の局在を調べたところ通常のHL-60細胞では細胞質に存在することが分かった。さらに、アポトーシスの際にcaspase-3によりAP-endonucleaseが活性化されることが判明した。
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