カニクイザル個体をモデルにした造血系の動態解析

1999 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 11671014
• 研究機関: 自治医科大学
• 研究代表者: 花園 豊 自治医科大学, 医学部, 講師 (70251246)
• キーワード: カニクイザル / 造血幹細胞 / レトロウイルスベクター / 骨髄移植 / 遺伝子標識 / GFP

研究概要

カニクイザルを用いてその個体レベルで造血幹細胞の動態に明らかにするために、本年度、我々は以下の実験を行った。
(1)カニクイザル自家骨髄移植の系の樹立:カニクイザルから骨髄血を採取し、CD34+細胞を単離し、全身放射線照射(500 cGy x 2)を行ったサルに自家移植した(7頭)。この際、無菌室管理、中心静脈栄養、輸血、抗生剤投与を必要としたが、死亡例なくおおむね安全に行うことができた。
(2)カニクイザル造血幹細胞の遺伝子標識:我々は、green fluorescent protein(GFP)を発現するレトロウイルスベクターを作製した。このベクターを用いてカニクイザル骨髄CD34+細胞を ex vivo で遺伝子標識した。これらの細胞を自家移植し、in vivoで遺伝子標識を追跡した。造血幹細胞遺伝子標識実験において最も重要な点は、幹細胞をいかに効率よく標識するかである。我々は、ベクター骨格を従来のモロニー白血病ウイルスからマウス幹細胞ウイルスに変更し、さらにベクターエンベロープをテナガザル白血病ウイルスのそれで置換した。また、遺伝子導入の際にFlt-3 ligandやトロンボポエチンといった新しいサイトカインやレトロネクチンを導入した。これらによって、現在、移植後、最長で9ヶ月になるが、骨髄前駆細胞の約2-20%がプロウイルス陽性であり、in vivoの遺伝子導入細胞をクローニングし、ベクター挿入部位を同定していくのは可能であると考えている。来年度は、レトロウイルスベクターのゲノムへ挿入部位をAlu PCR法等によって同定し、in vivoの遺伝子標識集団をクローナルに解析したい。

研究成果

• [文献書誌] Ogasawara,Y.et al.: "Potential application of dominant negative retinoic acid receptor genes for ex vivo expansion of hematopoietic stem cells"Gene Ther.Mol.Biol.. (in press).
• [文献書誌] Hanazono,Y.,et al.: "In vivo marking of rhesus monkey lymphocytes by adeno-associated viral vectors : direct comparison with retroviral vectors"Blood. 94. 2263-2270 (1999)
• [文献書誌] Kume,A.,et al.: "Hematopoietic stem cell gene therapy : a current overview"Int.J.Hematol.. 69. 227-233 (1999)
• [文献書誌] Yu,J.-M.et al.: "Expression of interferon-γ by stromal cells inhibits murine long-term repopulatin hematopoietic stem cell activity"Exp.Hematol.. 27. 895-903 (1999)
• [文献書誌] Hanazono,Y.et al.: "Genetic marking.In Hematopoietic cell transplantation 2nd edition"Edited by Forman,S.J.,Blume,K.G.,and Thomas,E.D.Blackwell Science,Inc.. 8 (1999)