| 研究概要 |
癌特異的遺伝子のプロモーターとしてCEAプロモーターを導入したアデノウイルスベクター導入用シャトルベクターを構築した.まずpGL3ベクターにCEA(他研究施設より供与)を導入し,βガラクトシダーゼ(LacZ)遺伝子をレポーターとして挿入したベクターを構築,これらを制限酵素で切り出してシャトルベクターpCA14に導入した.293細胞による相同組換えを利用してAdCEA-LacZが得られた.まずAdCEA-LacZとCEA産生癌細胞株PCI43,PCI35およびCEA産生のない株PCI19,正常細胞株1C3D3を用いて発現実験および治療実験を行った.コントロールベクターとして,CMVプロモーターでLacZを発現するアデノウイルスベクター(AdCMV-LacZ)を用いて比較検討した.
癌細胞の肝転移モデルを同時に構築した.エーテル麻酔下ヌードマウスの脾臓にPCI43を10E5個注入することによって約2週後には100%肝転移結節を作ることが明かになった.このモデルにおいて,癌注入後に前述のAdCEA-LacZを同経路で注入し,1週間後犠牲死させたマウスの肝転移巣をX-gal染色した結果,周囲の正常組織ではLacZの発現はみられなかったが,転移した癌細胞では高率にLacZの発現が確認された.このことから,CEAプロモーターを導入したアデノウイルスベクターは癌肝転移モデルにおいて副作用のない遺伝子導入系として利用できることが示唆された.
一方,治療遺伝子として,RhoCが転移関連遺伝子であることから,ヒト胎児腎細胞株293細胞よりRT-PCR法によってRhoC遺伝子をクローニングした.さらにRhoCの活性化必須ドメインであるコドン117のアスパラギンをチロシンに置換した変異体であるdomonant negative RhoC N117Yを構築した.現在N117Y発現アデノウイルスを構築中である.
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