| 研究課題/領域番号 |
11671216
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| 研究機関 | 金沢大学 |
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研究代表者 |
大村 健二 金沢大学, 医学部・附属病院, 講師 (30194301)
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| 研究分担者 |
金平 永二 金沢大学, 医学部・附属病院, 助手 (10251951)
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| キーワード | チミジル酸合成酵素 / 蛋白翻訳活性 / リピート構造 / 相補的逆配列 / 非翻訳領域 / 遺伝子クローニング / 試験管内転写アッセイ / 試験管内翻訳アッセイ |
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| 研究概要 |
ヒト大腸癌組織よりDNAを抽出し、PCR法にてTS遺伝子のGCrichな非翻訳領域に存在するリピート構造の数(2〜6)を確認した。次いで、リピート領域を挟むプライマーで各リピート構造の増幅を行った。さらに、得られたPCR産物をTAクローニング法を用いてクローニングした。
クローニングしたDNAフラグメントから、制限酵素RbaIとEcoRIでリピート領域を切り出し、full length TScDNAプラスミド(リピート長;3)のリピート領域を含むDNAフラグメントと組み換え、大腸菌にトランスフェクトして、2から6までのリピート長を持つ各TScDNAをクローニングした。
各リピート長を持つTScDNAプラスミドを精製し、このDNAを用いてin vitro transcription systemによりTSmRNAを作成、次いでreticulocyte lysate translation assayを用いて種々のリピート長を有するTSmRNAの翻訳活性を観察した。
得られた蛋白の放射活性をみると、リピート構造数の増加につれてTS蛋白の翻訳量が増加した。しかし、リピート構造の上流に位置する相補的逆配列を切り離すと、翻訳活性の著しい上昇を認めるともに、リピート構造数による翻訳活性の差も消失した。これら一連の現象は、TSmRNAにキャップ構造を付加しても同様であった。なお、翻訳された蛋白がTSであることはTSのポリクローナル抗体を用いたwestern blotting法によって確認した。
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