ホメオボックス遺伝子を用いた色素上皮細胞からの網膜神経細胞の分化誘導とその移植

2000 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 11671736
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 高橋 政代 京都大学, 医学研究科, 助手 (80252443)
• 研究分担者: 柏井 聡 京都大学, 医学研究科, 助教授 (50194717) ; 田辺 晶代 京都大学, 医学研究科, 助手 (80243020)
• キーワード: 色素上皮細胞 / 塩基性線維芽細胞成長因子 / 上皮細胞成長因子 / ホメオボックス遺伝子 / Rax / Crx / CHX10 / アデノウィルスベクター

研究概要

毛様体色素上皮細胞の培養と神経分化誘導
成体ラット毛様体組織を分離して色素上皮細胞側が下面になるようにして培養皿に接着させた。塩基性線維芽細胞増殖因子を加えた無血清培地を用いた培養により、毛様体組織から増殖して培養皿上に遊走する細胞が得られた。これらの細胞は多くが神経幹細胞のマーカーであるネスチンを発現するようになった。
毛様体色素上皮から増殖した細胞を引き続き神経分化誘導条件(血清添加)下で培養すると上皮様形態であった色素上皮細胞は劇的に形態を変化させ、一部には神経様突起をもった細胞も認められた。これらの細胞の一部はニューロンのマーカーであるNeurofilament200およびグリアのマーカーであるGlial Fibrilary Acidic Proteinを発現していた。ただしこの培養条件下では視細胞のマーカーであるオプシンの発現は得られなかった。
アデノウィルスを用いたCrxとGFPの遺伝子導入
次に視細胞に特異的に発現するホメオボックス遺伝子であるCrxを導入することにより、毛様体の色素上皮細胞が視細胞に分化しうるかについて検討した。
毛様体色素上皮細胞に対し、視細胞特異的ホメオボックス遺伝子であるCrxまたはレポーター遺伝子であるGFP(Green Fluorescein Protein)を組み込んだアデノウィルスを感染させた。引き続き神経分化誘導条件下で培養したのち免疫細胞化学的解析を行った。GFPを導入した毛様体色素上皮細胞からは視細胞のマーカーであるオプシン陽性細胞は得られなかったのに対し、Crxを導入した細胞ではオプシンを発現する細胞が多数認められた。
これらの結果から成体ラット毛様体色素上皮から末分化な神経幹細胞あるいは神経前駆細胞が得られ、Crxを遺伝子導入することにより、毛様体色素上皮細胞は視細胞に分化転換する可能性があることが示された。

研究成果

• [文献書誌] Takahashi M 他: "Rescue from photoreceptor degeneration in the rd mouse by human immunodeficiency Virus vector-mediated gene transfer."J.Virol.. 73. 7812-7816 (1999)
• [文献書誌] Nishida A 他: "Differentiation of the transplanted adult hippocampus-derived stem in adult rat retina with mechanical injury."Invest.Opthalmol.Vis.Sci.(suppl.). 40,4. 598-598 (1999)
• [文献書誌] Kurimnoto Y 他: "Transplantation of nueral stem cell into the retina injured by transient ischemia."Invest.Opthalmol.Vis.Sci.(suppl.). 40,4. 727-727 (1999)
• [文献書誌] Haruta M 他: "Retinal transplantation of the isolated progenitor cells from embryonic rat retina."Invest.Opthalmol.Vis.Sci.(suppl.). 40,4. 728-728 (1999)
• [文献書誌] Nishida A 他: "Incorporation and differentiation of hippocampus-derived neural stem cells transplanted in injured adult rat retina"Invest.Opthalmol.Vis.Sci.. 41,13. 4268-4274 (2000)
• [文献書誌] Akita J 他: "Differentiation of adult rat hippocampus-derived neural stem cells in the embryonic retinal organ culture"Invest.Opthalmol.Vis.Sci.(suppl.). 41,4. 14-14 (2000)
• [文献書誌] Mandai M,Takahashi M 他: "Long-Term Outcome After Radiation Therapy for Subfoveal Choroidal Neovascularization Associated with Age-Related Macular Degeneration."Jpn J Ophthalmol.. 44. 530-537 (2000)
• [文献書誌] Yu RT,Chiang MY, Tanabe T 他: "The orphan nuclear receptor Tlx regulates Pax2 and is essential for vision."Proc Natl Acad Sci USA.. 97. 2621-2625 (2000)
• [文献書誌] Takahashi M: "Tissue engineering for therapeutic use Vol.3.Ed.Yoshito Ikada"Elsvier Sience. 10 (1999)