| 研究課題/領域番号 |
11671780
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
山本 有平 北海道大学, 医学部・附属病院, 助手 (70271674)
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| 研究分担者 |
杉原 平樹 北海道大学, 大学院・医学研究科, 教授 (20002157)
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| キーワード | 遺伝子導入 / ha-tagベクター / トランスフェクタント / リポフェクション法 / エレクトロポーション法 / ゲルソリン / ゲルソリン短縮体 / ヒト皮膚悪性黒色腫 |
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| 研究概要 |
正常ヒト表皮角化細胞、正常ヒトメラノサイトの株化が困難であったため、角化細胞としてヒト食道癌細胞株であるHEC46、ヒトメラノサイト系細胞としてヒト黒色腫細胞株であるMeWo、G361、そしてCOS7の4細胞株を対象とした。導入遺伝子として、Hemoagurutinin(ha)-tagのプラスミド(pCMVha)、ヒト・ゲルソリン(アクチン調節蛋白質、質量90KDa)のcDNAをpCMVhaに組み込んだコンストラクト(pCMVhaGSN)の2種類を用意した。導入されたか否かは、トランスフェクタントから蛋白を抽出し、細胞が産生する、haが結合したゲルソリン(haGSN)がWestern法で抗ha抗体にて検出されるかどうかで判定した。ゲルソリンのマーカーとして、正常皮膚と皮膚悪性黒色腫組織における野生体ゲルソリンを、Western法で抗ゲルソリン抗体(GS-2C4)にて検出し、haGSNと分子量を比較した。
リポフェクション法ではCOS7、MeWoでhaGSNを強く検出可能であった。また、エレクトロポレーション法でも、MeWoでhaGSNを強く検出した。HEC46では、両方法において、極めて弱いもののhaGSNのバンドを認めた。本研究で我々は、偶然にもヒト悪性黒色腫組織において、通常の90KDaのゲルソリン以外に、交差反応する約85KDaのバンド(GSNp85)がウエスタンブロット法にて認められることを発見した。本短縮体は、過去に報告が無く、研究の主軸をこの短縮体の一次構造解明へと転じた。ヒト皮膚悪性黒色腫の原発組織ならびに転移組織38検体におけるゲルソリンの発現をウエスタン法で調べたところ、原発巣の陽性率は75.8%、再発・転移巣では100%であった。レベルII以上の厚さではp85の陽性率が有意に上昇し、一次構造は、C末端の欠失した短縮体であることが判明した。
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