| 研究概要 |
オステオカルシンは、骨芽細胞において特異的に産生されるタンパク質であり、その遺伝子発現には転写開始点上流域に骨芽細胞特異的な転写調節因子が結合し、転写を活性化することを研究代表者は明らかにしてきた。しかしながら、骨芽細胞分化には転写段階のみならず転写後の翻訳段階での制御が重要な役割を果たすことが示されてきた。そこで、骨芽細胞に存在するRNA結合タンパク質による翻訳制御が、骨芽細胞の分化に対してどのように機能するかについて明らかにするため本研究を行った。オステオカルシンmRNAの翻訳段階における骨誘導タンパク質(BMP)による翻訳制御調節を検討するために,C3H10T1/2細胞に組み換えBMP-2を添加し、経時的に細胞を抽出しシュークロースグラジィエント密度勾配遠心法を行い、いわゆるポリリボゾーム解析を行った。分取したサンプルを電気泳動し、オステオカルシンcDNAをプローブとしたノーザンブロット解析から、骨芽細胞分化に伴ってリボゾームの多く結合したオステオカルシンmRNAの増加した。次に、これらの翻訳制御領域を同定するためにマウスオステオカルシン遺伝子のさまざまな長さの5'非翻訳領域ならびに3'非翻訳領域を挿入したルシフェラーゼレポーターコンストラクトを作製した。これらのプラスミドを、カチオン性リポソームを用いてC3H10T1/2細胞に導入し、組み換えBMP-2を培地に加え培養を続けた後、細胞を回収し、ルシフェラーゼ活性を測定した。5'非翻訳領域を含むレポータープラスミドの導入によってルシフェラーゼ活性の上昇が認められた。更に、非翻訳領域の合成RNAをプローブとしたゲルシフトアッセイから、骨芽細胞分化に伴って結合の増加の認められる複数の翻訳制御タンパク質が存在した。この翻訳制御に機能するタンパク質が、骨芽細胞の分化過程に重要であることが明らかになった。
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