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1.Lactococcus lactis JK301からpGB301の抽出
アルカリSDS超遠心法により単一バンドの12.5ng/ulのpGB301を抽出した。
2.pGB301によるStreptococcus milleri 10707とS.gordonii ChallisとS.sanguis ATCC 35105の形質転換効率
ウマ血清を加えたTodd-Hewitt brothで培養した上記3株の質転換効率をpGB301のerythromycin分解酵素を指標として測定した。上記3株ともpGB301によってerythromycin耐性に形質転換され、1.5×10^4から5.5×10^4cfu/ugの形質転換効率を示した。この転換効率は菌の回収時間が早いほど高効率を示した。すなわち、菌を培地に植菌して、560nmでのoptical densityが0.1程度の時がもっとも効率がよい結果となった。電気的穿孔法により形質転換を行うと、効率は5倍に上昇することがわかった。
3.S.milleri 10707の低pH感受性変異株の作製
S.milleri 10707をEthyl methanesulfonateを用いて変異株を作製し、低pHに感受性を示す株を選択した。変異株は塩酸でpHを調整したpH5.0のTodd-Hewitt brothに植えると、pHが4.6になったところで成育を止めてしまうのに対し、親株は4.2まで成育した。この菌株の形質転換効率は1.4×10^3cfu/ugであった。
4.この場合の電気穿孔法の最適条件はPeak Voltage;2.5KV、Capacitance;25 F、Pulsecontroll;200Ω、培地中のの菌が濁度(OD_<560>)0.5程度の時形質転換効率が最大になることがわかった。
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