| 研究課題/領域番号 |
11672258
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
応用薬理学・医療系薬学
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
中川 晋作 大阪大学, 薬学研究科, 助教授 (70207728)
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| 研究分担者 |
久保 一義 大阪大学, 薬学研究科, 助教授 (00028846)
真弓 忠範 大阪大学, 薬学研究科, 教授 (00098485)
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| 研究期間 (年度) |
1999 – 2000
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| キーワード | 細胞質内遺伝子発現 / 遺伝子発現調節因子 / 細胞内動態 / 遺伝子治療 / 膜融合リポソーム |
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| 研究概要 |
我々が開発した膜融合リポソームは、細胞膜との融合により、細胞傷害性を与える事なく、いかなる物質でも細胞内に効率よく導入可能である。本研究では、膜融合リポソームを用いることで細胞内導入物質自身の動態特性・有用性を評価できる基盤技術の確立を試みた。まず、膜融合リポソームの細胞内物質導入ツールとしての安全性・効率などを評価した結果、構成脂質に陽電荷脂質(DC-Chol)を導入することにより、細胞傷害性を示すことなく、他の表面電荷膜融合リポソームよりも約10倍、細胞内物質導入効率が上昇した。導入できる遺伝子のサイズは、単に至適なリポソーム粒子径にするだけで、細胞内に15Kbという比較的大きなサイズの遺伝子をも導入することが可能であり、さらに遺伝子をスペルミジンと共に膜融合リポソーム内に封入することにより、遺伝子封入効率の向上や細胞内遺伝子導入効率の増強、封入遺伝子の安定化が可能となり、その遺伝子発現効率を著しく改善し得ることを明らかにした。また一般に導入遺伝子の核内への移行率は、核膜が一時的に消失する増殖性細胞においてさえ、0.1%程度と著しく低いことが知られている。そこで、遺伝子発現調節因子としてT7 RNAポリメラーゼをモデルとして、それとT7プロモーターを有するプラスミドDNA(pT7-IRES-L)とを同時に細胞質内に導入し、細胞質内で遺伝子発現させる評価系を構築した。本システムは、通常の核内における遺伝子発現とは完全に独立した形で、細胞質内で遺伝子発現を行わせるものであるため、細胞質内に導入した遺伝子発現調節因子の機能を直接評価できる。細胞内への物質導入ベクターとして膜融合リポソームを用い、pT7-IRES-LとT7 RNAポリメラーゼを細胞内に導入した結果、高い遺伝子発現が認められ、最大遺伝子発現は遺伝子導入後12時間目に認められた。また、pT7-IRES-L単独では遺伝子発現は認められないことから、本系において遺伝子発現調節因子そのものを評価可能であることが示された。また通常のリポソームを用いた場合、ほとんど遺伝子発現が認められなかった。以上の結果から、膜融合リポソームを用いることにより遺伝子のみならず遺伝子発現に関わる種々因子の安全性・有用性評価にも適用可能であることが示された。
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