| 研究概要 |
HGF(HGF;hepatocyte growth factor)の局所的活性発現を担うセリンプロテアーゼ(HGF activator)の2つの阻害因子(HAI)が近年申請者らにより単離され,膜結合性のKunitz型セリンプロテアーゼインヒビターであることが明らかになった。本研究ではHGFの活性制御を担うHAIのin vivoにおける役割を解明することを目的として機能解析を行い現在までに以下の知見が得られた。
1 HAIのプロセッシング機構を明らかにするため,HAIの発現細胞における蛋白質局在様式を解析した。(1)HAIに対して特異的なマウスモノクローナル抗体を作製し,発現細胞中におけるHAIの局在様式の変化・分泌型/膜結合型の量比変化を調べた。(2)HAIのC末側の膜結合領域欠失体に相当するcDNAをGFPベクターに組み込み動物細胞中で発現させ,共焦点レーザー顕微鏡を用いてHAI全長が発現した場合とin vivoでの蛋白質局在を比較検討した。その結果,2つのHAI共に膜結合型分子は膜表在的分布を呈する一方,分泌型分子は細胞質内に存在した(submitted)。
2 特定の機能ドメインが特定の機能発現に必須であるか調べるためHAIに存在する機能ドメインの各所が欠失した膜結合型ならびに分泌型の変異蛋白を発現させ個々の変異体について1と同等の手法で解析した。その結果,第1Kunitzドメインを含む膜型分子の細胞表層上でのHGF activatorとの相互作用が認められた。細胞内蛋白輸送の特異的阻害剤の実験系への導入も含め,以上の結果が機能ドメインの欠損による影響なのか現在解析中である。
3 膜結合型から分泌型が生成するプロセッシング機構を明らかにすることはHAIの生理的役割を理解する上で重要である。そこで,HAIの分泌酵素(secretase)を検索することを目的として酵母Two Hybrid法によりHAIと相互作用する機能分子を検索した。その結果,細胞骨格蛋白質等の若干の相互作用分子がHAIとin vivoで強く結合することが明らかとなった。これらのうちの一つは,アポトーシスに対し抑制的に作用すると考えられる蛋白質だった(unpublished results)。
今後も小胞体で生合成され細胞表層へ移行した膜結合型分子からの分泌型への変換ならびにそれ以降のプロセッシングにおけるHAIの機能制御に対する分子構造変化のメカニズムを解明することを目的として引き続き研究を進めていきたいと考えている。
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