筋小胞体Ca^<2+>-ATPaseの部位特異的変異による作動機構の解析

1999 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 11680622
• 研究機関: 旭川医科大学
• 研究代表者: 鈴木 裕 旭川医科大学, 医学部, 教授 (50183421)
• キーワード: カルシウムポンプ / カルシウムATPアーゼ / 筋小胞体 / 品質管理

研究概要

1.筋小胞体Ca^<2+>-ATPase(SERCA1a)の細胞質小ループのArg198の部位特異的変異による機能解析
Arg198を部位特異的変異により種々のアミノ酸で置換したSERCA1a変異体をCOS-1細胞で発現させ、ミクロソーム画分に回収して速度論的解析を行なった。その結果、Arg198の高い親水性と正電荷がリン酸化中間体の迅速な加水分解に必須であることを明らかとした。
2.SERCA1aのN末端細胞質領域のHis5とその近傍残基の部位特異的変異による機能解析
N末端領域(Glu2-Ala14)のアミノ酸残基を部位特異的変異により削除または置換したSERCA1a変異体をCOS-1細胞で発現させ、ミクロソーム画分に回収し、蛋白発現と機能について解析した。その結果、Ala3-Ser6はCa^<2+>輸送機能には必須でないこと、しかし、Ala3-Thr9は、蛋白の品質管理システムに感受性が高く、従ってこの領域はSERCA1a蛋白の正しいfoldingにきわめて重要であることを明らかとした。
3.筋小胞体Ca^<2+>-ATPaseの細胞質大ループに存在するSH_D(Cys344とCys364)領域の機能解析
リン酸化部位Asp351を囲むSH_D(Cys344とCys364)をN-エチルマレイミドで修飾すると、リン酸化中間体のADP感受型から非感受方への異性化がブロックされる。本研究では、水の活動度を下げると、この異性化が進行し、かつPiからの逆反応によってもADP非感受型リン酸化中間体が形成することを発見した。そしてSH_D領域は、触媒部位における水分子の排除と再流入に重要で、触媒サイクルの回転に必須な役割を果たすことを明らかとした。

研究成果

• [文献書誌] Takashi Daiho: "Deletions of Specific Substitutions of a Few Residues in the NH_2-terminal Region (Ala^3 to Thr^9) of Sarcoplasmic Reticulum Ca^<2+>-ATPase Cause Inactivation and Rapid Degradation of the Enzyme Expressed in COS-1 Cells"The Journal of Biological Chemistry. 274・34. 23910-23915 (1999)
• [文献書誌] Takashi Daiho: "Mutations of ArgD1^<198> in sarcoplasmic reticulum CaD1^<2+>-ATPase cause inhibition of hydrolysis of the phosphoenzyme intermediate formed from inorganic phosphate"FEBS Letters. 444・1. 54-58 (1999)
• [文献書誌] Hiroshi Suzuki: "Formation of the ADP-Insensitive Phosphoenzyme Intermediate in the Sarcoplasmic Reticulum Ca^<2+>-ATPase of Which both Cys344 and Cys364 Are Modified by N-Ethylmaleimide"Biochemistry. 38・2. 820-825 (1999)
• [文献書誌] 大保貴嗣: "筋小胞体CaD1^<2+>-ATPaseのN末端領域(Ala^3-Thr^9における2-3残基の削除または特異的置換は失活とCOS-1細胞内での速い分解を引き起こす"生化学. 71・8. 933 (1999)
• [文献書誌] 鈴木裕: "筋小胞体CaD1^<2+>-ATPase1分子あたり1個存在するATP結合部位のうち半数のみがリン酸化中間体を形成する触媒部位である"生化学. 71・8. 644 (1999)
• [文献書誌] Hiroshi Suzuki: "The Na/K-ATPase and Related ATPases"Elsevier,North Holland (K.Taniguchi and S.Kaya Eds.). 8 (2000)
• [文献書誌] Takashi Daiho: "The Na/K-ATPase and Related ATPases"Elsevier,North Holland (K.Taniguchi and S.Kaya Eds.). 4 (2000)
• [文献書誌] Kazuo Yamasaki: "The Na/K-ATPase and Related ATPases"Elsevier,North Holland (K.Taniguchi and S.Kaya Eds.). 4 (2000)