筋小胞体Ca^<2+>-ATPaseの部位特異的変異による作動機構の解析

2000 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 11680622
• 研究機関: 旭川医科大学
• 研究代表者: 鈴木 裕 旭川医科大学, 医学部, 教授 (50183421)
• キーワード: Ca^<2+>ポンプ / Ca^<2+>ATPase / 筋小胞体 / リン酸化中間体 / 品質管理 / 部位特異的変異 / P-type ATPase

研究概要

筋小胞体Ca^<2+>-ATPaseはATPの加水分解に共役して、Ca^<2+>を細胞質から小胞体内腔へ輸送する。その触媒過程では、ATPのγ-リン酸基がAsp351に転移してリン酸化中間体(EP)が形成し、その異性化と加水分解が順次起こる。本研究では、本酵素の構造と機能について、次のような成果を得た。
1.Asp351近傍のSH_D(Cys344 ＆ Cys364)をN-エチルマレイミド修飾するとEPの異性化がブロックされるが、水の活動度を下げて触媒部位からの水分子の排除を促進すると、SH_D修飾酵素でもEPの異性化が生起することを発見した。これにより、EPの異性化に必須である触媒部位からの水分子排除にSH_D領域は重要であることを明らかにした。
2.本酵素の細胞質領域は3つのドメイン(リン酸化-、ATP結合-、及びA-ドメイン)からなる。これまで機能が不明であったAドメインについての部位特異的変異により、このドメイン中のArg198はEPの迅速な加水分解に必須であり、加水分解時にはリン酸化部位のごく近傍に位置することを明らかにした。
3.Aドメイン中のHis5とその近傍領域は、EP加水分解時にリン酸化部位近傍に位置すること、この領域は小胞体による品質管理に感受性が高く、細胞内でCa^<2+>-ATPase蛋白が正常で安定な高次構造を形成し発現するために必須であることを、部位特異的変異と細胞内における蛋白発現・分解の解析により、明らかにした。
4.Trypsin、proteinase K、及びV8-proteaseによる切断実験により、EPの異性化に伴いCa^<2+>-ATPaseはこれらproteasesに対し強く抵抗性のコンパクトな構造となること、この構造は細胞質の3つのドメインが集まった構造であることを明らかにし、ATP加水分解過程で細胞質の3つのドメインが大きく動くことを明らかにした。

研究成果

• [文献書誌] Stefania Danko,Takashi Daiho,Kazuo Yamasaki,Mika Kamidochi, Hiroshi Suzuki and Chikashi Toyoshima : "ADP-insensitive phosphoenzyme intermediate of sarcoplasmic reticulum Ca^<2+>-ATPase has a compact conformation resistant to proteinase K,V8 protease and trypsin."FEBS Letters. 489・2-3. 277-282 (2001)
• [文献書誌] Hiroshi Suzuki,Takashi Daiho,Kazuo Yamasaki,and Tohru Kanazawa: "Only half of the Ca^<2+>-ATPase molecules present in sarcoplasmic reticulum vesicles can be phosphorylated with ATP or Inorganic phosphate."Na/K-ATPase and Related ATPases.(K.Taniguchi and S.Kaya Eds.) Elsevier, North Holland. 381-388 (2000)
• [文献書誌] Takashi Daiho,Kazuo Yamasaki,Hiroshi Suzuki,Tomoyuki Saino,and Tohru Kanazawa: "Deletions or specific substitutions of a few residents in the NH2-terminal Ala3-Thr9 region of sarcoplasmic reticulum Ca^<2+>-ATPase cause inactivation and rapid degradation of the enzyme expressed in COS-1 cells."Na/K-ATPase and Related ATPases.(K.Taniguchi and S.Kaya Eds.) Elsevier, North Holland. 293-296 (2000)
• [文献書誌] Kazuo Yamasaki,Takashi Daiho,Hiroshi Suzuki,Tomoyuki Saino,and Tohru Kanazawa: "Mutations of arginine-198 in sarcoplasmic reticulum Ca^<2+>-ATPase cause inhibition of hydrolysis of the phosphoenzyme intermediate formed from inorganic phosphate"Na/K-ATPase and Related ATPases.(K.Taniguchi and S.Kaya Eds.) Elsevier, North Holland. 297-300 (2000)
• [文献書誌] Takashi Daiho,Kazuo Yamasaki,Hiroshi Suzuki,Tomoyuki Saino,and Tohru Kanazawa: "Deletions or Specific Substitutions of a Few Residues in the NH2-terminal Region (Ala3-Thr9) of Sarcoplasmic Reticulum Ca^<2+>-ATPase Cause Inactivation and Rapid Degradation of the Enzyme Expressed in COS-1 Cells."The Journal of Biological Chemistry. 274・34. 23910-23915 (1999)
• [文献書誌] Takashi Daiho,Hiroshi Suzuki,Kazuo Yamasaki,Tomoyuki Saino,and Tohru Kanazawa: "Mutations of Arg198 in Sarcoplasmic Reticulum Ca^<2+>-ATPase Cause Inhibition of Hydrolysis of the Phosphoenzyme Intermediate Formed from Inorganic Phosphate."FEBS Letters. 444・1. 54-58 (1999)
• [文献書誌] Hiroshi Suzuki and Tohru Kanazawa: "Formation of the ADP-Insensitive Phosphoenzyme Intermediate in the Sarcoplasmic Reticulum Ca^<2+>-ATPase of Which both Cys344 and Cys364 Are Modified by N-Ethylmaleimide"Biochemistry. 38・2. 820-825 (1999)
• [文献書誌] 上堂地美佳,大保貴嗣,山崎和生,鈴木裕: "筋小胞体Ca^<2+>-ATPaseのVal-200への部位特異的変異導入はCa^<2+>-ATPase活性を抑制する"生化学. 72・8. 886 (2000)
• [文献書誌] 大保貴嗣,山崎和生,上堂地美佳,鈴木裕: "筋小胞体Ca^<2+>-ATPaseのC876-C888ジスルフィド結合はATP加水分解とCa^<2+>輸送の共役に重要である"生化学. 72・8. 887 (2000)
• [文献書誌] 山崎和生,大保貴嗣,上堂地美佳,鈴木裕: "筋小胞体Ca^<2+>-ATPaseのマグネシウム・フッ素複合体はCa^<2+>非存在下でのC_<12>E_8による可溶化に対して安定である"生化学. 72・8. 887 (2000)
• [文献書誌] 鈴木裕,大保貴嗣,山崎和生,金沢徹: "筋小胞体Ca^<2+>-ATPase1分子あたり1個存在するATP結合部位のうち半数のみがリン酸化中間体を形成する触媒部位である"生化学. 71・8. 642 (1999)
• [文献書誌] 大保貴嗣,山崎和生,鈴木裕,齋野朝幸,金沢徹: "筋小胞体Ca^<2+>-ATPaseのN末端領域(Ala^3-Thr^9)における2-3残基の削除または特異的置換は失活とCOS-1細胞内での速い分解を引き起こす"生化学. 71・8. 935 (1999)