シネフンギン生合成酵素の精製と触媒機構の解明

2000 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 11680636
• 研究機関: 岡山大学
• 研究代表者: 稲垣 賢二 岡山大学, 農学部, 教授 (80184711)
• 研究分担者: 田村 隆 岡山大学, 農学部, 助教授 (40253009) ; 田中 英彦 岡山大学, 大学院・自然科学研究科, 教授 (90065912)
• キーワード: シネフンギン / メチル化酵素 / 二次代謝 / 放線菌宿主ベクター系 / DNAメチラーゼ阻害試験

研究概要

前年度に続き、シネフンギン生合成酵素の生産性向上と酵素の安定化及び精製法を検討したが、活性が微弱で不安定であり精製も困難であった。そこでまず先にシネフンギン生合成酵素の遺伝子クローニングを行うことにした。通常のクローニング技術で必要とされる目的酵素の構造情報がないため、放線菌の宿主ベクター系を利用して発現された酵素によって生産されるシネフンギンを指標にクローニングを行なうことにした。放線菌のプロモーターは大腸菌内では作用しないので放線菌Streptomyces lividans TK24を宿主とした。シネフンギン生産菌Streptomyces incarnatusのゲノムDNAをSau3AI限定分解して調製した10kb DNA断片を放線菌用ベクターpKU110に連結してStreptomyces lividans TK24に形質転換した。一枚の寒天平板培地上に形質転換体50株を培養し、活性炭1gと3M酢酸緩衝液(pH5.3)と共にオートクレーブした。活性炭を洗浄後、吸着した核酸系化合物を50%アセトン水で回収してDNAメチラーゼ阻害試験の試料とした。試料をλファージDNA、EcoRIメチラーゼ、SAMと共にインキュベートした後、EcoRI制限酵素で処理した。50株のグループ中に1つでもシネフンギン生産株があれば、λDNAは制限酵素で切断されてアガロースゲル電気泳動上で特徴的なラダーを生成する。標品のシネフンギンを用いたメチラーゼ阻害試験では、SAMの1/10倍量のシネフンギンが存在すればメチラーゼ阻害を起こすことが確認された。この簡便なアッセイ法により、シネフンギン様活性を示したグループが同定された。グループ内の個別の株について、さらにアッセイを行った結果,3コロニーにシネフンギン様活性が検出された。これらの株を5ml培養し,陽イオン交換クロマトグラフィー(Dowex50W×8)で粗分画して、HPLCによる標品との比較を行うことにより、本試料がシネフンギンを含んでいることが示された。

研究成果

• [文献書誌] Kawaguchi,H.,K.Inagaki,H.Matsunami,Y.Nakayama,T.Tano,H.Tanaka: "Purification and Characterization of 3-Isopuropylmalate Dehydrpgenase from Thiobacillus thiooxidans"J.Biosci.Bioeng.. 90(4). 459-461 (2000)
• [文献書誌] Inoue,H.,K.Inagaki,N.Adachi,T.Tamura,N.Esaki,K.Soda and H.Tanaka: "Role of Tyrosine 114 of L-Methionine γ-Lyase from Pseudomonas putida"Biosci.Biotech.Biochem. 64・11. 2332-2339 (2000)
• [文献書誌] Ohhira,I.,T.Tamura,H.Kurokawa,H.Nakaue,K.Inagaki,and H.Tanaka: "Purification of anti-Escherichia coli O-157 components produced by Enterococcus faecalis TH10, an isolate from Malaysian fermentation food, Tempeh"Milk Science. 49・2. 81-88 (2000)
• [文献書誌] Seow,T.-K.,K.Imagaki,T.Nakamura,R.Maeda,T.Tamura,and H.Tanaka: "Purification and Some Characteristics of a Monomeric Alanine Racemase from an Extreme thermophile, Thermus thermophilus"J.Biosci.Bioeng. 90・3. 344-346 (2000)
• [文献書誌] Tamura,T.,Y.Oki,A.Yoshida,T.Kuriyama,H.Kawakami,H.Inoue,K.Inagaki and H.Tanaka: "Noncompetitive, reversible inhibition of aminoacylase-1 by a series of 1-α-hydroxyl-and 1-α-fluoro-fatty acids ; the ligand specificity of Aspergillus oryzae and porcine kidney enzymes"Archives Biochem.Biophys.. 379・2. 261-266 (2000)
• [文献書誌] Lim,L.-C.,T.Tamura,R.Rahim,M.Ali,H.Ghazaki,K.Inagaki and H.Tanaka: "A colourimetric screening method for microorganisms that have methionine γ-lyase activity"Asia Pacific J.Mol.Biol.Biotech.. 8・1. 95-97 (2000)
• [文献書誌] Motoshima,M.,K.Inagaki,T.Kumasaka,M.Furuichi,H.Inoue,T.Tamura,N.Esaki,K.Soda,N.Tanaka,M.Yamamoto,and H.Tanaka: "Crystal Structure of the Pyridoxal-5'-phosphate Dependent L-methionine γ-lyase from Pseudomonas putida"J.Biochem.,. 128・3. 349-354 (2000)