研究概要 |
本年度はアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AAT)と芳香族アミノ酸アミノトランスフェラーゼ(ART)について触媒過程におけるプロトン移動機構を詳細に調べた。AATにおいてはPLP-Lys258シッフ塩基の塩基性が反応の進行に伴って変化することが触媒作用に重要な役割を有する。部位特異的変位とX線結晶解析により調べた結果,シッフ塩基の塩基性の変化は従来考えられた基質カルボキシル基の静電的効果はわずかであり,大部分が酵素のコンフォメーション変化に伴うシッフ塩基の捩れの解消によってもたらされていることが判明した。さらに,2つのドメイン間に位置するAsn194がこのコンフォメーション変化をシッフ塩基に伝えていたことが判明し,このクラスの酵素で強く保存されていた同残基の役割が初めて明らかになった。この成果をもとに,ARTの反応機構を調べた。ARTにおいては負荷電がより少ない芳香族アミノ酸基質の方が酸性アミノ酸基質よりもシッフ塩基のpK_aを高めている機構が謎であったが,X線結晶解析で得られた図を詳細に検討すると,芳香族基質の芳香環がPLPの近傍に位置しているTrp140を圧迫し,そのためにPLPのピリジン環の変位を通じてシッフ塩基の捩れを解消し,大きなpK_aの上昇をもたらすことが判明した。 以上のことは,酵素内部の解離基のpK_aが,静電的相互作用のみならず解離基自体やその解離基を取り巻くタンパク質のコンフォメーション変化によって説明されることを示している。さらにプロトン数座標軸を取った三次元的なエネルギー準位の考察を行うことで,コンフォメーション等の歪みのエネルギーが酵素触媒の本質であり,解離基のpK_aはそれに派生した二次的なものであることを明らかにした。このようにして,酵素内部の解離基の解離現象・プロトン移動についての本質的理解を行うための方法論を提唱した。これは今後の酵素触媒研究において重要な意義を有すると考えられる。
|