哺乳類細胞の細胞表面に発現する70kD熱ショック蛋白質の分子クローニング

1999 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 11680703
• 研究機関: 札幌医科大学
• 研究代表者: 鳥越 俊彦 札幌医科大学, 医学部, 講師 (20301400)
• 研究分担者: 佐藤 昇志 札幌医科大学, 医学部, 教授 (50158937)
• キーワード: 分子シャペロン / 熱ショック蛋白質 / HSP70 / Lamin B1 / Daudi細胞 / 発現クローニング / 腫瘍抗原 / 腫瘍免疫

研究概要

細胞表面に発現する70kD熱ショック蛋白質(HSP70)の遺伝子をクローニングするために,Daudi細胞からcDNAライブラリーを作製し,以下の3種類の方法でクローニングを行っている.
(1)PCRクローニング法
細胞表面に発現するHSP70を認識する抗体NT22のエピトープをmappingした.その結果,NT22は細胞質に発現する既知のHSC73蛋白質のアミノ酸345-373の領域を認識することが判明した.そこで,この領域をコードするDNA配列をもとにしてprimerを作製し,PCRによって相同配列を有するcDNAのクローニングを試みた.その結果,HSC73とは異なるPCR産物が1種類得られ,現在そのDNA配列を決定しようとしている.
(2)蛋白質アミノ酸配列の決定
AffinityクロマトグラフィーによってNT22抗原を精製し,限定分解産物のアミノ酸配列を決定した.その結果,Lamin B1蛋白質と同じ配列が得られた.recombinant Lamin B1蛋白質を作製し,NT22抗体の反応性を解析したところ,NT22抗体はLamin B1蛋白質と反応した.しかし,ポリクロナル抗Lamin B1抗体は,細胞表面のNT22抗原と反応しなかったことから,NT22抗体のcross-reactivityであることか判明した.
(3)発現クローニング法
Daudi細胞から,発現クローニングのために2種類のライブラリーを作製した.1つは,通常の発現クローニングのためにpcDNAI/amp vectorに挿入したライブラリー,他の1つはsignal sequence trap法のためにpDisplay vectorに挿入したライブラリーである.現在,これらのライブラリーを用いてcDNAクローニングを行っている.

研究成果

• [文献書誌] Sogahata, K. Torigoe, T., Ishikawa, M., Kamiguchi, K, Taya, Y., Sato, N. et al: "Sensitivity to proteasome-mediated degradation of dephosphorylated retinoblastoma protein is regulated by molecular chaperones,HSC73 and HSP40"Cancer Res.,2000. (in press). (2000)
• [文献書誌] Sato, N., Nabeta, Y., Kondo H., Sahara, H., Torigoe, T. et al: "Human CD8 and CD4 T cell epitopes of epithelial cancer antigens."Cancer Chemother. Pharmacol.. (in press). (2000)
• [文献書誌] Akazawa, T., Hirai, I., Hirohashi, Y., Sahara, H., Torigoe, T., Tamura, Y., and Sato, N. et al: "A novel negative regulator molecule, Cho-1, is involved in the cytotoxicity by human natural killer cells but not in cytotoxic T lymphocytes."Microbiol Immunol.. 43. 285-291 (1999)
• [文献書誌] Suzuki, K., Sahara, H., Okada, Y., Hirata, K., Kikuchi, K., Sato, N. et al: "Identification of natural antigenic peptides of a human gastric signet ring cell carcinoma recognized by HLA-A31-restricted cytotoic lymphocytes"J. Immunol.. 163. 2783-2791 (1999)
• [文献書誌] Tsuruma, T., Yagihashi, A., Hirata, K., Torigoe, T., Araya, J., Watanabe, N., and Sato, N.: "Interleukin-10 Reduces Natural Killer(NK) Sensitivity of Tumor Cells by Downregulating NK Target Structure Expression."Cell Immunol.. 198. 103-110 (1999)
• [文献書誌] Fujiwara, O. and Torigoe, T.: "Analysis of TAP-dependent translocation of cytosolic peptides-Distinct optimal conditions among peptides-."Sapporo Med. J.. 68. 21-29 (1999)