マキシザイムを利用したホヤ胚遺伝子機能抑制実験系の確立

1999 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 11680728
• 研究機関: 甲南大学
• 研究代表者: 西方 敬人 甲南大学, 理学部, 助教授 (80212116)
• キーワード: マキシザイム / DNAザイム / polIIIプロモーター / メトキシ化 / ホヤ / 母性mRNA

研究概要

近年、機能性核酸の研究が進み、そのin vivoへの応用が様々な分野で注目されている。しかしリボザイムを確実に細胞内で働かせるには、まだ不確定な要素が多い。特に、培養細胞ではなく、個体としての生物体でリボザイムを機能させるには困難が多い。一方、ホヤは卵内にあらかじめ母性mRNAが局在し、それらの働きが体を作り上げていくうえで非常に重要であると考えられている。しかし、特定の遺伝子の機能破壊実験系が確立されておらず、遺伝子の機能の証明が大変難しかった。そこで、マキシザイムを用いて胚性に発現する遺伝子を、DNAザイムを用いて母性mRNAの機能阻害実験系を確立することを目的とした。
本年度はまず、マキシザイムを効率的に発現させるためのヒトpolIIIプロモーター配列がホヤでも有効に機能するかどうかを確かめた。ヒト培養細胞中で安定にマキシザイムを発現することが確かめられているプラスミドをホヤ受精卵に顕微注入し、マキシザイムの転写の有無をRT-PCRにより調べた。十分量のプラスミドが注入されているにも関わらず、発生時間によらず、マキシザイムの転写量はごくわずかであった。ホヤ胚内で高い転写活性を持つ、ホヤ自身のpolIIIプロモーター配列を単離することが必須となった。現在、ホヤのtRNA遺伝子の上流配列の単離および検討を行っている。一方、両末端をメトキシ化したDNAザイムを設計し、それを未受精卵に注入し、6-24時間放置することで卵内の標的mRNAがほとんど消滅することが分かった。この過程で、DNAザイムの効率的設計法もほぼ確立できた。今後この実験系を用いて、母性mRNAを特異的かつ効率的に破壊する実験系を確立し、ホヤ母性mRNAの機能を証明していく。

研究成果

• [文献書誌] Tanaka,K.J.: "The transcript coding for an RNA-binding protein is localized in the anterior side of the ascidian 2-cell stage embryo"Development,Genes and Evolution. 210(in press). (2000)
• [文献書誌] Tanaka.K.J.: "An ascidian glycine-rich RNA-binding protein is not induced by temperature-stress but is expressed under a genetic program during embryogenesis"Gene. 243. 207-214 (2000)
• [文献書誌] Kawashima,T.: "Expression patterns of musashi homologus of the ascidians,Halocynthiaroretzi and Ciona intestinalis"Development,Genes and Evolution. 210. 162-165 (2000)
• [文献書誌] Tanaka,K.J.: "A non-radioactive gel shift protocol enables recovery of RNA-binding proteins"Technical Tips Online. T01794 (1999)
• [文献書誌] Nakamori,R.: "Characterization of MTR1 : A novel protein correlated with the myoplasmic movement during ascidian ooplasmic segregation"Memoirs of Konan University,Science Series. 46. 25-33 (1999)
• [文献書誌] Nishikata,T.: "The CAB(Centrosome-Attracting Body),microtubule system,and posterior egg cytoplasm are nvolved in positioning of cleavage planes in the ascidian embrvo"Developmental Biology. 205. 72-85 (1999)
• [文献書誌] Okubo,M.A.: "Generation and characterization on of a monoclonal antibody,mH1,raised against mitotic HeLa cells"Development,Growth&Differentiation. 41. 381-389 (1999)
• [文献書誌] Chiba,S.: "Interactions between cytoskeletal components during ooplasmic segregation in the myoplasm of ascidian eggs"Development,Growth&Differentiation. 41. 265-272 (1999)
• [文献書誌] Wada,M.R.: "The expression of the protochordate homologue of the proteasome regulatory subunit Rpn12is transcriptionally and post-translationally regulated during cleavage stage"Zoological Science. 16. 125-129 (1999)