真核生物染色体DNA複製装置とS-期チェックポイント制御

1999 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 11694277
• 研究種目: 基盤研究(A)
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 杉野 明雄 大阪大学, 微生物病研究所, 教授 (90231737)
• キーワード: 染色体DNA複製開始機構 / DNAポリメラーゼ / Cdc7p / Dbf4p複合体 / 蛋白リン酸化酵素 / Mcm2-7蛋白群 / Rad53蛋白 / Mcm10蛋白 / Sー期チェックポイント

研究概要

a)Mcm2-7蛋白、Mcm10蛋白の精製と染色体DNA複製における役割:現在までに、分子遺伝学的、生化学的研究より、Mcm2-7蛋白は細胞周期G_2/M期において細胞質から核に移行し、染色体DNA複製をS期に1回だけ保障する"Licensing Factor"として機能していると考えられている。これらの蛋白群の染色体DNA複製開始または鎖伸長反応にどうかかわっているかを解明するため、これらの複合体と相互作用している複製蛋白因子の解明を行った。その結果、Mcm10蛋白とMcm2、Mcm5、Dna2、Slm2、やPolε subunitであるDpb3 Dpb4 Dpb11やPolδ のsubunitであるPol32、Hys2と遺伝的な相互作用があることが明らかになった。又、Mcm2蛋白が複製開始に必須なCdc7p/Dbf4pリン酸化酵素の基質になっていることを明らかにした。しかしMcm2蛋白がCdc7p/Dbf4p複合体の基質になるためには、あらかじめ、別のキナーゼのよってリン酸化されていなければならないことを明らかにした。
b)Rad53蛋白による複製開始の制御機構: 染色体の上に多数ある複製開始部位はS-期に一斉に活性化されるのではない。この複製開始部位の活性化の制御に、S期やDNA損傷チェックポイント制御に関与するRad53 protein kinaseが関与していることが明らかになりつつある。このRad53 蛋白の複製開始反応における機能を解析する目的で、まずRad53 蛋白をHydroxyurea 未処理と処理した出芽酵母細胞から大量に精製した。こうして精製したRad53 蛋白を用い試験管内で、以前に精製した、Cdc7p/Dbf4p キナーゼ複合体をリン酸化し、Cdc7p/Dbf4p 複合体が有する、Mcm2リン酸化酵素活性を阻害することを明らかにした。これらの結果を基に、Rad53 蛋白による複製開始部位の活性化制御に関する新しいモデルを提唱した。

研究成果

• [文献書誌] Kamimura,Y.: "DNA helicase III of Saccharomyces cerevisiae, encoded by YER176w(HEL1), highly unwinds covalently closed, circular DNA in the presence of a DNA topoisomerase and yRF-A"Journal of Biochemistry. 125. 236-244 (1999)
• [文献書誌] Johnston,L.H.: "First the CDKs, now the DDKs"Tends in Cell Biology. 9. 249-252 (1999)
• [文献書誌] Masumoto,H.: "Dpb11 controls the association between DNA polymerase α and ε, and the ARS region of budding yeast"Molecular and Cellular Biology. in press. (2000)
• [文献書誌] Kihara,M.: "The Cdc7p/Dbf4p ARS-binding and portein kinase activities are both required for entry to S phase and are regulated by Rad53p in Saccharomyces cerevisiae"Molecular Cell. in press. (2000)
• [文献書誌] Gary R.: "A novel role in DNA metabolism for the binding of Fenl/Red27 to PCNA and implications for genetic risk"Mol Cell Biol. 19. 5373-5382 (1999)
• [文献書誌] Tran H.T.: "Genetic factors affecting the impact of DNA polymerase delta proofreading activity on mutation avoidance in yeast"Genetics. 152. 47-59 (1999)
• [文献書誌] Tran H.T.: "The 3'-->5' exonucleases of DNA polymerases delta and epsilon and the 5'-->3' exonuclease Exo1 have major roles in postreplication mutation avoidance in Saccharomyces cerevisiae"Mol Cell Biol.. 19. 2000-2007 (1999)
• [文献書誌] Kroutil L.C.: "Deletion errors generated during replication of CAG repeats"Nucleic Acids Res.. 27. 3481-3486 (1999)
• [文献書誌] Labib K.: "G1-phase and B-type cyclins exclude the DNA-replication factor Mcm4 from the nucleus"Nat. Cell Biol.. 1. 415-422 (1999)
• [文献書誌] Santocanale C.: "Activation of dormant origins of DNA replication in budding yeast"Genes Dev.. 13. 2360-2364 (1999)
• [文献書誌] Noton E.: "CDK inactivation is the only essential function of the APC/C and the mitotic exit network proteins for origin resetting during mitosis"Mol.Cell.. 5. 85-95 (2000)
• [文献書誌] Ferreira M.F.: "Dbf4p, an essential S phase-promoting factor, is targeted for degradation by the anaphase-promoting complex"Mol Cell Biol.. 20. 242-248 (2000)
• [文献書誌] Neecke H.: "Cell cycle progression in the presence of irreparable DNA damage is controlled by a Mec1-and Rad53-dependent checkpoint in budding yeast"EMBO J.. 18. 4485-4497 (1999)
• [文献書誌] Weinreich M.: "Cdc7p-Dbf4p kinase binds to chromatin during S phase and is regulated by both the APC and the RAD53 checkpoint pathway"EMBO J.. 18. 5334-5346 (1999)
• [文献書誌] Weinreich M.: "The Cdc6p nucleotide-binding motif is required for loading mcm proteins onto chromatin"Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 96. 441-446 (1999)
• [文献書誌] Chong J.P.: "A double-hexamer archaeal minichromosome maintenance protein is an ATP-dependent DNA helicase"Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 97. 1530-1535 (2000)
• [文献書誌] Johnston,L.H.: "Progress in Cell Cycle Reseach (Meijier,L.,Jezequel,A.,and Ducommun,B.,eds.) Plenum Press,New York,USA Vol.4"A Cdc7-Dbf4 kinase activity is conserved from yeast to human. 8 (199)