新規微生物酵素アルドキシム脱水酵素を用いたニトリル合成

1999 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 11760074
• 研究機関: 富山県立大学
• 研究代表者: 加藤 康夫 富山県立大学, 工学部, 助教授 (20254237)
• キーワード: aldoxime / nitrile / acclimation / dehydratase / screening / identification / Bacillus / Rhodococcus

研究概要

本年度の研究の概要としては、1)アルドキシム分解微生物のスクリーニング、2)分離菌株中からの新規アルドキシム脱水酵素の検索と本酵素反応の確認、及び活性株の同定を行った。以下、その詳細について具体的に述べる。
1)自然界からのアルドキシム分解微生物のスクリーニング
スクリーニングに用いるアリール及びアルキルアルドキシム類を有機合成の手法を用いて化学合成した。この際、合成の為の各種試薬及びガラス器具を購入した。合成化合物の構造確認は現有の核磁気共鳴スペクトル、赤外吸収スペクトルや質量分析装置等の各種分析機器を用いた。次に、合成したアルドキシムを分解する能力を有する微生物を自然界からスクリーニングした。スクリーニングの際、微生物の培養には現有の恒温槽または振とう培養機を用い、培地用の各種試薬を購入した。土壌、植物、湖水、活性汚泥等より、アルドキシムを単一炭素、窒素または炭窒素源とした培地を用い、スクリーニングを行った。アルドキシム類は微生物に対し毒性が強く、かつ難分解性であったため、スクリーニングにおいては、集積培養法と馴養培養法を併用して行うことが効果的であった。その結果、多数のアルドキシム分解微生物を得た。
2)分離株中からの新規アルドキシム脱水酵素の検索と本酵素反応の確認及び活性株の同定
スクリーニングにより得られた各種の微生物株の中から、アルドキシムからニトリルへの脱水酵素活性を産生する菌株を選定した。酵素活性の測定や反応生成物の特定を行うために、現有の分光光度計、高速液体クロマトグラフィー等の装置を用いた。また、微生物の大量培養や菌体の分離、および無細胞抽出液の調製に、現有のジャーファーメンターや連続遠心分離装置、および細胞破砕装置を用いた。分離された各活性株を、その菌学的諸性質に基づいて同定した。その際、種々の同定用の培地成分を購入し、外部の微生物株同定機関に同定依頼も行った。その結果、フェニルアセトアルドキシム分解菌としてBacillus sp.OxB-1株を、ピリジン-3-アルドキシム分解菌としてRhodococcus sp.YH3-3株を得た。

研究成果

• [文献書誌] Y.Kato et al.: "Synthesis of Optically Active α-Monobenzoyl Glycerol by Asymmetric Transesterification of Glycerol"Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic. (in press).
• [文献書誌] Y.Kato et al.: "A Convenient Method of Preparing Optically Active N-Trityl-Aziridine-2-(S)-Carboxylate Esters from β-Halo-(S)-Amino Acides"Journal of Chemical Society Chemical Communications. 245-246 (2000)
• [文献書誌] Y.Kato et al.: "A Novel Heme-containing Lyase, Phenylacetaldoxime Dehydratase from Bacillus sp. strain OxB-1: Purification, Characterization, and Molecular Cloning of the Gene"Biochemistry. 39. 800-809 (2000)
• [文献書誌] Y.Kato et al.: "A Novel Method for Preparation of Optically Active α-Monobenzoyl Glycerol via Lipase-Catalyzed Asymmetric Transesterification of Glycerol"Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 9. 3207-3210 (1999)
• [文献書誌] Y.Kato et al.: "Nitrile Hydratase Involved in Aldoxime Metabolism from Rhodococcus sp. strain YH3-3-Purification and Characterization"European Journal of Biochemistry. 263. 662-670 (1999)
• [文献書誌] Y.Kato et al.: "A New Enzymatic Method of Nitrile Synthesis by Rhodococcus sp. strain YH3-3"Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 6. 249-256 (1999)