| 研究概要 |
本研究は,糖輸送体の高度に分化した高等動物組織細胞内での局在分布機構,特に間接的にエネルギーを消費し能動的に糖を細胞に取り込むナトリウムイオン依存型糖輸送体SGLT1の頂部細胞膜への移送経路の解明を目的に行った.SGLT1遺伝子の発現を自在にコントロールする事によってその頂部細胞膜局在メカニズムを移送・局在機構を分離して解析するために,培地に添加するドキシサイクリンの濃度に応じてSGLT1遺伝子発現のオン・オフと発現量を調節できるシステムをMDCK細胞に組み込んだTetOff-SGLT1遺伝子発現システムを構築した.さらにこのシステムを利用し,ドキシサイクリンを培地から除去しSGLT1を発現誘導した後に培地にテトラサイクリンを再添加し遺伝子発現を停止させチェイス培養するパルス発現-チェイス培養システムを構築した.様々な時間チェイス培養した後にMDCK細胞を固定し,発現産物の細胞内局在を,凍結準超薄切片蛍光抗体染色法,共焦点レーザー顕微鏡法,蛍光顕微鏡法,免疫電子顕微鏡法などを組み合わせ解析する事によって,SGLT1が細胞内で合成された後に直接頂部細胞膜に移送されていることが明らかとなった.現在このシステムを用いて,SGLT1の頂部細胞膜への直接的な移送システムが細胞極性形成過程の何処で構築されるのかを解析中である.
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