| 研究概要 |
1.研究の目的
我々は、細胞膜修復が細胞内の小胞を介して行われることを証明した(J.CellBiol.,95,97).また、細胞膜損傷修復にかかわる細胞内アクチンフィラメントの動態を胃粘膜上皮由来細胞を用いて明らかにした(Nat.CellBiol.投稿中)。しかしながら,膜損傷によって損傷した細胞の細胞内小器官などの修復機構、修復後の長期の膜動態ついては全く不明てある.本研究では、膜損傷修復後の細胞内および細胞膜動態を形態学的に観察することを目的としている。
2.研究実施と結果
(1)損傷修復によって引き起こされるオートファジー
胃粘膜上皮由来培養細胞(RGM1)はまたは線維芽細胞(NIH3T3)を蛍光デキストラン(Fdx/Txdx)または西洋ワサビペロキシダーゼ(HRP)中で損傷し,その後,経時的(15s,30m,1h,6h,24h,36h,7d)に固定し,蛍光顕微鏡および透過型電子顕微鏡で観察した.その結果,蛍光顕微鏡では損傷後6時間で,透過型電子顕微鏡では損傷後30分で,細胞質に蛍光デキストランまたはHRPの顆粒構造が確認された.この顆粒化は,損傷後7日までゆっくりとおこなわれた.さらに超微構造の解析によって,その顆粒は壊れた細胞内小器官を含んでおり,オートファゴゾームと考えられた.また、それらの顆粒内に酸性フォスファターゼ反応がみられ,pHも低かった.これらのことにより,細胞膜損傷後,細胞はオートファゴゾームを形成し,損傷した細胞内小器官や細胞質を取り除こうとすることが示唆された.
(2)損傷修復によって引き起こされるエンドサイトーシス
ウニ受精卵を用い,細胞膜を損傷後のエンドサイトーシスを観察した.受精膜をグリシンによって除去し,22Gのシリンジ針で損傷し,その後カルセイン,HRPまたはFM4-64に浸積して,エンドサイトーシスを蛍光顕微鏡,共焦点レーザー蛍光顕微鏡,および透過型電子顕微鏡で観察した.その結果,損傷後30分において,明瞭なエンドサイトーシスが観察された.このことは,膜損傷したする際のエクソサイトーシスによって細胞内から足された膜をエンドサイトーシスによって引き戻す反応であることが考えられた.
3.発表・報告
本研究結果は米国細胞生物学会および解剖学会で報告した.また,本研究途上で発生した結果についても,Jornal of CellScienceに報告した.
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