|
1.CPE受容体の細胞膜内存在様式(トポロジー)の解明。
CPE受容体のトポロジーを解析するために、5つある親水性領域にN-glycosylationモチーフを導入した変異CPE受容体発現プラスミドを構築した。各cDNAを犬膵臓マイクロソーム膜存在下、非存在下でin vitro転写・翻訳し、SDS-PAGEでの分子量の増加を指標として糖鎖付加の有無を検討した。N末端側から2番目の親水性領域にN-glycosylationモチーフを導入した変異体で分子量の増加が観察されたことから、この領域が細胞外に露出していることが推察された。また、5番目の親水性領域を認識する抗CPE受容体抗体を用いた蛍光抗体法により、CPE受容体のC末端は細胞質内に配向していることを確認した。以上の結果は、CPE受容体がN末端、3番目の親水性領域およびC末端を細胞質側に、また2番目の親水性領域を細胞外に向けていることを示唆する。一方、CPE受容体の4番目の親水性領域が、毒素感受性に必須であることを申請者は明らかにした。細胞外から加えたCPEが、細胞膜表面のCPE受容体と結合するというこれまでの知見に基づき、この領域が細胞外に露出したCPE結合ドメインであると考えている。4番目の親水性領域は22アミノ酸からなる非常に短い配列であるため、その一部が細胞膜内に埋もれており、in vitro転写・翻訳の系では、糖鎖の付加がで効率よく起こらなかった可能性がある。来年度の実験において、4番目の親水性領域とのCPEとの直接の結合を証明することにより、CPE受容体のトポロジーの全体像が明らかにできると考える。
2.CPE受容体の細胞膜内での多量体化の確認
CPE受容体のin vitro翻訳産物および培養細胞由来のCPE受容体について、ショ糖密度勾配遠心法により多量体化の有無を確認したが、安定な複合体の形成は認められなかった。
|
