|
免疫・炎症性細胞の中で、B細胞、骨髄球系細胞、マスト細胞に発現する新規膜表面受容体分子PIRのリガンド分子の同姓を柱として、PIRが免疫・炎症反応において果たす役割を明確にすることを目的とした研究を、11年度研究計画に則り遂行した。その成果を以下2項にまとめる。
1.PIRの細胞外領域を含むプローブタンパクおよびPIRを発現する細胞の準備
リガンド結合領域が多価(ポリマー)かつ可溶性タンパクとして発現する合成キメラタンパクのデザインとその為のDNA構築を行った。合成キメラタンパクの基本骨格は、ペプチドN末端側から、PIR-Bの細胞外領域、ヒトC4bp(complement 4-binding protein)のα-ヘリックス領域および標識配列となるFLAG領域とした。C4bp領域は、システイン結合特性により7量体を形成するため、C4bp領域に連結したPIRの細胞外領域(部分領域を含む)は、ホモポリマーの可溶性タンパクで回収されることが期待された。293T細胞に上記キメラDNA構築を一過性に発現させ、培養上清や細胞分画を抗FLAG抗体を用いた免疫沈降やウエスタンブロット法で解析した。その結果、期待される合成キメラタンパクは、ポリマーとして(約5〜7量体)細胞内には蓄積するものの、培養上清より回収可能な可溶性タンパクとして発現しないことが判明した。nativeなリガンド結合活性を維持しながら、大量の合成キメラタンパクの精製には、培養上清より回収する手順が必須であると考えた為、現在、キメラDNA構築をミエローマ細胞に安定に発現させて、培養上清からの回収を試みている最中である。
2.PIRのリガンドを発現する細胞種の同定
今後、1.のプローブタンパクが調整されしだいに実施する予定でいる。リガンドとしては、細胞表面タンパクに限らず、可溶性タンパクや糖脂質なども考慮しながら解析を進めていく計画である。
|
