| 研究概要 |
本年度は、変異体カドヘリンを組み込んだアデノウイルスベクタ-の作製・精製を行った。E-カドヘリン、デスモグレイン3、デスモコリン3の細胞外部領域を一部欠失させてC末端にseven c-myc tagを付けたcDNAをPCR法により作製し、それぞれのcDNAをloxP-adenovirus cassette cosmidに組み込んだcosmidを作製した。EcoT22I制限酵素で処理したadenovirus5 del-X DNAと共に293細胞にリン酸カルシウム法にてtransfectionして、homologus recombinationにより組換えアデノウイルスベクタ-を作製した。これら組換えウイルスを293細胞に感染させDNAを回収し、ClaI,EcoRIなどの制限酵素切断にて目的ウイルスを確認した。目的組換えウイルスを293細胞に感染させ、大量培養を行い、293細胞を回収し超音波処理後塩化セシウム密度勾配法にてウィルス液の精製、濃縮を行い、PBS-grycelolに対して透析した。ウィルス力価を測定し(〜1x10^<10>pfu/ml)、-80℃保存を完了した。また、これらウイルスをnormal human keratinocyteに感染し、抗myc抗体にて確認した。E-カドヘリン、デスモグレイン3、デスモコリン3の細胞外部領域を一部欠失させた変異体の発現が確かめられた。
|
