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1、ヒト毛包におけるprotease nexin-1(PN1)の局在
PN1に対するRNA probeおよび抗体を作製するため、以下の方法でsignal peptideを除いた全長PN1 cDNAの発現ベクターの構築、蛋白発現およびその精製を終えた。
(培養ヒト毛乳頭細胞からtotal RNAを抽出→RT-PCR法にて上記のPN1 cDNAを増幅→PCR産物をpGEM-T Easy Vectorにクローニング→pGEX-4T-3 Vectorにサブクローニング→塩基配列、フレーム、方向性に異常ないことをシークエンスにて確認→GST-PN1蛋白の発現誘導→Batch法にて蛋白を精製→抗GST抗体を用いたWestern blottingで確認→thrombinを用いてPN1をGSTから分離→アミノ酸シークエンスで確認)
現在In vitro transcription法によるdigoxigenin標識RNA probeおよびPN1発現蛋白に対するモノクローナルおよびポリクローナル抗体を作製中である。
2、結合織性毛包細胞で発現されるPN1 mRNAに対する男性ホルモンの影響
10^<-8>Mのdihydrotestosterone存在下で培養した結合織性毛包細胞からtotal RNAを抽出し、RT-PCRおよびslot blot hybridization法を用いて半定量的にPN1 mRNAの発現量をcontrolと比較した。しかし両者に有意な差は認められなかった。
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