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25-水酸化ビタミンD 1α-水酸化酵素(1α-水酸化酵素)は、腎臓においてビタミンDを活性化する重要な酵素である。本酵素は活性型ビタミンDによりネガティブフィードバックを受けることが酵素活性のレベルで証明されているが、遺伝子レベルでの調節機構は未だ不明である。本研究では1α-水酸化酵素遺伝子の上流解析を通じてビタミンDの負の調節に関する分子機構を解明することを目的とした。昨年度の我々の検討では、ルシフェラーゼアッセイやゲルシフトアッセイを使って、ヒト1α-水酸化酵素遺伝子の上流領域にビタミンDに反応するnegative vitamin D response element(nVDRE)を約20塩基の間に同定した。本年度は、この領域にどのような因子がビタミンD受容体と協調して関与するのかを酵母のtwo-hybrid法を用いて検討した。
腎臓の近位尿細管由来のcDNA libraryを用いてtarget proteinを発現させ、bait proteinであるビタミンD受容体と相互作用をもつ因子を複数単離した。得られたcDNAには、既知のものも含まれていたが、bHLH型の転写因子と考えられる蛋白をコードする新たな遺伝子も得られた。それぞれの遺伝子につき、各臓器での発現パターンを検討した。さらには発現蛋白がnVDREに結合するかをゲルシフトアッセイを使って検討した。今後、ビタミンD受容体と共発現させることでビタミンDの遺伝子発現抑制が認められるのかを確認する予定である。
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