| 研究概要 |
申請者は,種々の発酵条件下(好気,微嫌気および高度嫌気条件下各種糖類の種々濃度)におけるS.mutansのpflとactの発現状況を,好気的な実験環境下で容易に検出できるようにするため,pfl,actそれぞれとレポーター遺伝子との融合遺伝子のS.mutansへの導入を試みた.先ず大腸菌においてベクター上にpfl,actそれぞれとレポーター遺伝子cat(クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子)との融合遺伝子を作成,この融合遺伝子でS.mutansGS-5株を形質転換し,嫌気的条件下で培養したときにレポーター遺伝子を発現する変異株を分離した(S.mutansのPFLは嫌気的条件下でその酵素活性が上昇すると報告されているため).また,申請者はRT-PCR法を用いm-RNA転写レベルからも,直接的にpflとactの発現をモニターする実験にも着手した.種々の発酵条件下で培養したS.mutansから全RNAを分離し,5'端に特別な塩基配列(GCリピート)をテールとして含むプライマーでRT反応を行い,続いてこのテール領域を3'端側のプライマーとしてPCR反応を行い(S.mutansから全RNAを分離するときにどの様にしても極少量の染色体DNAが混入するため,染色体DNAからの増幅を避けるための方法),増幅されたPCR産物をGENESCANシステム(パーキンエルマージャパン-アプラオドバイオシステムズ)を用いて定量的に解析している.現段階で,上記の方法によりpflとactの発現状況を解析した結果,本来PFLが酵素として機能しない好気的条件下(PFLはラジカル酵素であり,活性型は強い酵素感受性を示し好気的条件下では速やかに失活するため)でも,pflとactが発現していることが確認され,両者が構成酵素である可能性が示唆された.
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