| 研究概要 |
耳下腺細胞における水・電解質分泌の調節機構を明らかにするために、耳下腺細胞の主要な細胞内メッセンジャーであるカルシウム・シグナルとサイクリックAMPのクロストークを調べた。
1.蛍光色素 fura-2によるカルシウム反応の解析 フェニレフリンやカルバコールによるカルシウム動員反応がイソプロテレノールによって増強された。イソプロテレノールの増強反応がAキナーゼの阻害薬によって抑制される事、アデニルシクラーゼを直接活性化するフォルスコリンがイソプロテレノールと同様の増強反応を起こす事などから、AキナーゼによるIP_3受容体のリン酸化によってカルシウム反応の増強が起こる事が示唆された。
2.蛍光色素 SPQによる塩素イオン放出反応の解析 カルバコールによって起こる塩素イオン放出反応がイソプロテレノールによって増強された。βアドレナリン受容体は、カルシウム反応を増強する事により耳下腺のイオン分泌反応に関与する事が明らかになった。
3.生化学的解析 IP_3受容体のリン酸化を解析するために、type-1,type-2,type-3の3つのIP_3受容体サブタイプのC末端のアミノ酸配列から、それぞれのサブタイプに特異的なポリクローナル抗体を作成した。この抗体を用いて耳下腺細胞に発現するIP_3受容体のサブタイプを同定したところ、type-2とtype-3が多く発現してる事が明らかになった。
IP_3受容体のリン酸化を解析するために、IP_3受容体の免疫沈降を行う条件の最適化を行った。今後、この方法を用いてイソプロテレノール刺激やCキナーゼの活性化によってリン酸化されるIP_3受容体のサブタイプを明らかにする実験を計画している。さらにサポニン穿孔細胞を用いて、IP_3受容体のリン酸化によるカルシウム放出反応の変化を直接的に解析する計画である。
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