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1.M3E3/C3細胞の変化の検出
【all-transレチノール添加】 細胞を、レチノールを加えた条件において分化誘導培養を行い、肺の分化マーカーであるサーファクタント蛋白Sp-BとSp-C、及びCCSP(クララ細胞特異的分泌タンパク質)、HNF3α(肝細胞核因子)についてmRNAの発現変化を定量PCRによって検出する系を確立した。細胞は肺のクララ細胞様の分化形質を示すことがわかった。
【hypoxia条件】 hypoxia条件において分化誘導培養を行い、神経内分泌細胞の分化マーカーであるクロモグラニンAについて発現変化をPCRによって検出する系を確立した。この結果、細胞は肺のNeuroendocrine細胞様の分化形質を示すことが示唆された。
2.ホルモン様物質の暴露による影響
上記の細胞分化系にエストラジオールを添加すると、Sp-B、及びCCSPの発現が減少したが、Sp-Cについては増加した。また、クロモグラニンAの発現はエストラジオールにより減少することがわかった。
3.調節因子の解析
ホルモン様物質が分化の更に上流に与える影響を探るために、肺における転写調節を行っている因子(HNF3α、TTF-1)について、PCRにより検出したところ、細胞分化に伴い発現は増加した。
4.エストロゲンレセプターの発現解析
ER-αについてはM3E3/C3細胞サンプルにおいて発現が検出されたが、エストラジオール添加による影響はみられなかった。β型レセプターの検出を試みたが発現量が少なく検出が困難であった。
5.エストロゲンの影響の解析
エストラジオールの影響は、この細胞の分化因子の発現に対して抑制的であることが示唆された。その影響を分子レベルで解析する為に、ホメオボックス領域に特異的なprimerを設計し、3'-RACE法を用いて検出を試みたところ、HoxA5について、発現が抑制される傾向が示された。
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