結晶構造解析によるノンヘム鉄を含む2原子酸素添加酵素LigABの反応機構解析

1999 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 11780425
• 研究機関: 長岡技術科学大学
• 研究代表者: 千田 俊哉 長岡技術科学大学, 工学部, 助手 (30272868)
• キーワード: 2原子酸素添加酵素 / 無酸素条件 / X線結晶構造解析 / 蛋白結晶学 / 基質複合体 / 反応中間体 / 変異体蛋白質

研究概要

変異体蛋白質の作成
本年度は、変異体蛋白質の作成の技術的確立と実際の変異体蛋白質の作成を行った。基質の認識や活性に必要な残基を、既に決定している立体構造を用いて推定し、これらの残基に対して変異体の作成を行った。現在得られている変異体は、活性に必須であると考えられるHis195と、基質の認識に重要な働きをしていると考えられるSer269の変異体である。Ser269の変異体に関しては、その活性が半分ほどに低下するという予備的な結果を得ている。今後、これらの変異体の立体構造解析及び酵素学的な解析を行う予定である。また、他の変異体についても、現在作成中であり、平成12年度には新たに作成した変異体を用いて立体構造解析及び生化学的解析の両面からの解析を本格化させる。
無酸素実験の技術の確立
酵素-基質-NOの3者複合体の立体構造解析を行うには、1)無酸素条件下での結晶化、2)無酸素条件下での基質複合体の作成、3)無酸素条件下での3者複合体の作成、4)極低温下でのX線回折データ測定の条件確立、が必要であるが、本年度はこれらの技術的確立を行い、必要な装置(無酸素チャンバー等)を独自に作成した。この装置を用いて類縁酵素であるBphCにおいて酵素-基質-NOの3者複合体の構造解析を成功させた。現在、LigABを用いて、再活性化方法の確立、Batch法による結晶化条件の確立を行っている。既に技術的に困難な点は、今年度全て克服したので、平成12年度中には反応中間体複合体の結晶構造が得られると考えている。

研究成果

• [文献書誌] Sugimoto K.: "Purification and crystallization of a protocatechuate 4,5-dioxygenase LigAB from Sphingomonas pausimobilis SYK-6"Protein and Peptide Lett.. 6. 55-58 (1999)
• [文献書誌] Sugimoto K.: "Crystal structure of an aromatic-ring-opening dioxygenase LigAB, a protocatechuate 4,5-dioxygenase, in aerobic condition"Structure Fold Des.. 7. 953-965 (1999)
• [文献書誌] Sugimoto K.: "Purification and Crystallization of a Catechol 2,3-Dioxygenase PheB from Bacillus stearothermophilus BR219"Protein and Peptide Lett.. 6. 403-406 (1999)
• [文献書誌] Ohtsubo Y.: "PcpA, which is involved in the degradation of pentachlorophenol in Sphingomonas chlorophenolica ATCC39723, is a novel type of ring-cleavage dioxygenase"FEBS Letters. 459. 395-398 (1999)