氷温でのタンパク質構造変化と進化工学による高機能化因子の関連

1999 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 11780469
• 研究機関: 神戸大学
• 研究代表者: 田村 厚夫 神戸大学, 自然科学研究科, 講師 (90273797)
• キーワード: タンパク質 / 氷温 / 進化工学 / フォールディング

研究概要

枯草菌由来のタンパク質分解酵素subtilisinは、N末端より前にプロペプチド部分が存在して始めて正しい立体構造をとる。これは遺伝情報で指定されているが、立体構造を形成後、自己分解的にプロペプチドは切断され、成熟体subtilisinとなる。
このプロペプチドは、単独では立体構造がないことが知られているが、これとアミノ酸配列に20%程度の相同性を持ったPOlA1というタンパク質性インヒビターは、ヒラタケという食用キノコ由来であり、進化的には無関係にもかかわらず、安定な立体構造をとる。この立体構造を核磁気共鳴法で誤差0.9オングストローム以下の高精度に決定した。この結果の構造は、プロペプチドがsubtilisinに結合した状態で取っている構造と類似していることを見い出した。また、このタンパク質の安定性を温度変化と変性剤濃度の変化に対して、分光学的に観測し、構造転移の詳細を調べた。この結果、native状態からdenatured状態への構造転移は2状態であり、またこの構造転移に伴う熱量は非常に小さいため、低温変性(氷温付近に温度を下げた場合にタンパク質構造が壊れること)を起こすことを発見した。また、この構造変化を速度論的に観測したところ、遷移状態が変性剤濃度に応じて変化していくことがわかった。
一方、subtilisin本体についても、氷温で高機能化を果たすため、人工進化を行い、氷温で2倍高活性なものについて安定性の測定を行うとともに、subtilisin inhibitorについて構造の詳細を調べた。

研究成果

• [文献書誌] Shohei Koide: "Multi-step denaturation of Borrelia burgdorferi OspA,a protein containing a single-layer β-sheet"Biochemistry,. 38. 4757-4767 (1999)
• [文献書誌] Hiroaki Sasakawa: "Backbone 1H,13C,and 15N resonance assignments of Strepromyces subtilisin inhibitor"J.Biomol.NMR,. 14. 285-286 (1999)
• [文献書誌] Peter L.Privalov: "Comments on the comments"Protein Engineering,. 12. 187 (1999)
• [文献書誌] Hiroaki Sasakawa: "Secondary stuctures and structural fluctuation in a dimeric protein,Streptomyces subtilisin inhibitor"J.Biochem,. 126. 859-865 (1999)
• [文献書誌] Keisuke Tominaga: "Spectroscopic application of THz radiation generated by ultrashot pulses -Static far infrared absorption measurements in condensed phases"Advances in Multiphoton Processes and Spectoroscopy,. (印刷中). (2000)
• [文献書誌] Atsuo Tamura: "Cold denaturation and foldeng/unfolding of a protein at low temperature in Excerpta Medica ICS"ELSEVIER,Amsterdam. 7 (1999)