|
1.メダカ視細胞特異的グアニル酸シクラーゼ遺伝子の転写調節領域の機能解析:OlGC3とOlGC4の遺伝子上流領域にレポーター遺伝子をつないだ融合遺伝子を作製し、メダカ卵に顕微注入して、レポーター遺伝子の発現を調べることにより上流領域の機能を解析した。上流領域を段階的に5'側から削った結果、OlGC3では転写開始点の上流388bpまでの領域が、OlGC4では転写開始点の上流1227bpまでが視細胞特異的な遺伝子発現に必要であることが分かった。つぎにシス調節配列としてCrx/Otx転写因子の結合コンセンサス配列とホメオドメイン転写因子Rxが結合するRet1/PCE1配列に注目し、上流領域に塩基置換変異を導入してレポーター遺伝子の発現を調べた。その結果、OlGC3では-36/-31に位置するOtx結合コンセンサス配列が視細胞での遺伝子発現に必須であることが判明した。Ret1/PCE1配列はOlGC3の視細胞での発現に重要ではないようであった。一方、OlGC4の視細胞での発現にはOtx/Crx結合配列は必須ではないことがわかった。OlGC4の発現にはRet1/PCE1配列が重要である可能性がある。以上の結果から、(1)Otx型の転写因子がOlGC3の発現調節に関わっていること、(2)OlGC4の視細胞特異的な転写活性化にはOtx/Crx因子以外の転写因子が主要な役割を果たしていることが示唆された。
2.視細胞特異的な転写調節に関わる転写調節因子の解析:1の実験により、Crx/OtxやRxがOlGC3とOlGC4の視細胞特異的発現調節に関与することが示唆された。そこで他の動物種間で保存されたアミノ酸配列をもとに設計したプライマーを用いてPCRを行なうことにより、これらの転写因子のメダカホモログcDNA断片の単離を試みた。
|
