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本年度の研究実施計画に基づき研究を行ったところ下記の進展があった。
CHO細胞がつくるα5(IV)鎖
11年度の解析からCHO細胞が分泌するIV型コラーゲンはα5(IV)のみであることが明らかになったが、本年度はCHO細胞から分泌されるα5(IV)がどのような形であるかについてさらに検討を行った。
CHOの培養液を濃縮後、非還元でSDS-PAGEを行ったところモノマーのα5(IV)が検出されるのみで、高分子量の会合体を形成しているものは確認されなかった。さらに未変性のα5(IV)鎖NC1領域を認識する抗体で免疫沈降を行ったがこの抗体で沈殿するα5(IV)は検出されなかった。以上の結果からCHO細胞の発現するα5(IV)はらせん構造をとらないモノマーの形で分泌されていることがわかった。
α6(IV)鎖cDNA導入を行ったCHO細胞株の解析
11年度の解析よりα6(IV)鎖全長をコードするcDNA断片を含む発現ベクターを導入したCHO細胞において培養液中と細胞層中でα6(IV)鎖が認められたが、この培養液を濃縮後に未変性のα5(IV)鎖を認識する抗体で免疫沈降を行い、これに対してウェスタンブロットを行ったところα5(IV)鎖とα6(IV)鎖が共存することがわかった。また逆に未変性のα6(IV)NC1領域を認識する抗体を用いて免疫沈降による沈殿物についても同様にα5(IV)鎖とα6(IV)鎖が認められた。
以上の結果は
1.α5(IV)鎖だけではらせん会合体を形成しない、
2.α5(IV)鎖とα6(IV)鎖でらせん会合体を形成する
ことを反映していることを示唆するものである。
現在は電子顕微鏡を用いたロータリーシャドウ法で会合体の形態観察を行っている。
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