ダイオキシンなどの難分解性化合物のバイオレメディエーション

2001 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 11794005
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 大森 俊雄 東京大学, 生物生産工学研究センター, 教授 (20011984)
• 研究分担者: 野尻 秀昭 東京大学, 生物生産工学研究センター, 助教授 (90272468) ; 西山 真 東京大学, 生物生産工学研究センター, 助教授 (00208240) ; 山根 久和 東京大学, 生物生産工学研究センター, 教授 (80090520)
• キーワード: ダイオキシン / Bioremediation / Bioaugmentation / 遺伝子転移 / Phytoremediation / モニタリング / 形質転換植物

研究概要

1.2種類のダイオキシン分解菌[dibenzofuran(DF)資化菌Terrabacter sp. DBF63株とcarbazole(CAR)資化菌Pseudomonas resinovorans CA10株]について、各々の塩素化ダイオキシンに対する分解能を調べた。その結果、CA10株のCAR初発酸化酵素は、本実験で使用した全ての1〜3塩素化ダイオキシンに対して分解活性を示したが、DBF63株のDF初発酸化酵素も、2,7-DCDD以外の基質を全て分解できることが示された。これら塩素化ダイオキシン分解菌について、ダイオキシン分解条件の最適化を行った。これらの細菌を用いてダイオキシン実汚染土のバイオレメディエーションを試みたところ、CA10株またはDBF63株の1回添加・一週間の反応でそれぞれ8.3%及び10%の塩素化ダイオキシンが減少した。
2.Fluorogenic probe assay、competitive PCR及び内部標準菌体を組み合わせて使用することにより、carAa遺伝子とCA10株の数に関して、迅速、高感度かつ正確な定量を行うことが可能となった。加えて、このリアルタイムcompetitive PCR法とGFPマーカーを用いた直接計数法を併用することで、土壌中のcarAa遺伝子とCA10株の消長についてもモニタリングが可能となった。
3.CAR分解菌Pseudomonas sp. K23株を供与菌、フェノール分解菌Pseudomonas sp. DS1株を受容菌とした接合実験を行ったところ、受容菌当たり約107の頻度でCAR分解能を獲得した形質転換株を得た。これら形質転換株はDS1株由来であり、メガプラスミドpCAR2を保持していることが示された。
4.DBF63株のダイオキシン分解系メタ開裂酵素DbfB細胞質、小胞体、アポプラストでの発現用plasmidを構築し、シロイヌナズナ、タバコの形質転換を行った。得られた形質転換植物のRT-PCR・ウエスタン解析により、当該遺伝子が転写、発現していることが示された。DbfB発現植物体を液体培養し、培養液中の活性を測定した結果、アポプラスト発現区で顕著な活性が検出され、植物体外へのDbfB分泌も示された。

研究成果

• [文献書誌] Hiroshi Habe, et al.: "Degradation of Chlorinated Dibenzofurans and Dibenzo-p-dioxins by Two Types of Bacteria Having Angular Dioxygenases with Different Features"Applied and Environmental Microbiology. Vol.67, No.8. 3610-3617 (2001)
• [文献書誌] Hiroshi Habe, et al.: "Preliminary Examinations for Applying A Carbazole-Degrader, Pseudomonas sp. Strain CA10, to Dioxin-Contaminated Soil Remediation"Applied Microbiology and Biotechnology. Vol.56, No.5-6. 788-795 (2001)
• [文献書誌] Hiroshi Habe, et al.: "Degradation Characteristics of A Dibenzofuran-Degrader Terrabacter sp. Strain DBF63 Toward Chlorinated Dioxins in Soil"Chemosphere. (印刷中).
• [文献書誌] Hiroshi Habe, et al.: "Bioremediation of Dioxin-Contaminated Soils by Different Types of Bacteria"Proceedings of the Sixth International in-Situ and on-Site Bioremediation Symposium. Vol6, No.6. 111-118 (2001)
• [文献書誌] Jaka Widada, et al.: "Quantification of The Carbazole 1,9a-Dioxygenase Gene by Real-Time Competitive PCR Combined with Co-extraction of Internal Standards"FEMS Microbiology Letters. Vol.202, No.1. (2001)
• [文献書誌] Jaka Widada, et al.: "Enhanced Degradation of Carbazole and 2,3-Dichlorodibenzo-p-dioxin in soils by Pseudomonas resinovorans strain CA10"Chemosphere. (印刷中).
• [文献書誌] Jaka Widada, et al.: "Molecular Detection and Diversity of Polycyclic Aromatic Hydrocarbon-Degrading Bacteria Isolated Geography Diverse Sites"Applied Microbiology and Biotechnology. Vol.58, No.2. 202-209 (2002)
• [文献書誌] Hideaki Nojiri, et al.: "Rapid, Sensitive, and Accurate Monitoring Method for Augmented Dioxin-Degrading Bacteria"Proceedings of the Sixth International in-Situ and on-Site Bioremediation Symposium. Vol6, No.4. 51-58 (2001)